基礎生物化學酶課件

1、1,第三章 酶 （enzyme）,2,掌握酶的概念及催化特性了解酶的分類及結構與功能的關系掌握酶的作用機理掌握酶促反應的機理及其動力學了解一些重要的酶類了解酶的調節(jié)方式了解維生素的重要的輔酶形式,學習目的,3,一. 酶的研究簡史,公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。1857年，巴斯德（Pasteur）：酒精發(fā)酵是酵母細胞活動的結果；1878年，德國生理學家?guī)於魈岢雒福ㄔ醋韵ＥD語“在酵母中”）的概念。1897年，B&

2、#252;chner兄弟用不含細胞的酵母提取液實現(xiàn)了發(fā)酵，證明發(fā)酵無需活細胞；,The Nobel Prize in Chemistry 1907,"for his biochemical researches and his discovery of cell-free fermentation",4,1913年，Michaelis和Menten提出酶促動力學原理----米氏學說; 1926年，Sumner首次

3、提取出脲酶并證明其本質是蛋白質；,The Nobel Prize in Chemistry 1946,Sumner,Stanley,Northrop,"for their preparation of enzymes and virus proteins in a pure form","for his discovery that enzymes can be crystallized",1/

4、2 of the prize,1/4 of the prize,1/4 of the prize,5,1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶（ribozyme）的概念1995年，Jack W.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme),6,酶（enzyme）：是活細胞合成的、對其特異的底物起高效催化作用的蛋白質。核酶（ribozyme）：是近年

5、來發(fā)現(xiàn)的對RNA具有高效特異催化作用的RNA，其作用主要參與RNA的剪接。脫氧核酶(deoxyribozyme)：具有催化活性的DNA,具催化作用的生物物質：,7,酶是生物細胞產(chǎn)生的，以蛋白質為主要成分的生物催化劑。酶催化的生物化學反應，稱為酶促反應（Enzymatic reaction）在酶的催化下發(fā)生化學變化的物質，稱為底物（substrate）。,二. 酶是生物催化劑（ biocatalysts ）,1. 酶的概念,1.

6、1 酶的概念,8,極高的催化效率 酶促反應的速度比非酶促反應通常要快105~1017 倍高度專一性 鉑：催化許多反應，包括有機反應 H+：淀粉、脂肪、蛋白質、蔗糖等 酶：作用于結構近似的分子，甚至只催化一種化合物易失活催化活性受到調節(jié)、控制有些酶的催化活性與輔因子（cofactor）有關,1.2 酶的作用特點,9,一種酶只能作用于某一類或某一特定物質，這就是酶的

7、專一性（specitificity）專一性主要取決于酶的活性中心的構象和性質酶的專一性分為兩種情況： 結構專一性（structure specitificity ） 立體異構專一性（stereospecitificity ）,2. 酶的專一性,10,根據(jù)酶對底物結構的要求不同，分為相對專一性和絕對專一性。絕對專一性(absolute specificity) ：這些酶對底物有非常嚴

8、格的要求，只作用一種底物。 如脲酶只作用于尿素而不作用于其衍生物 (如尿素的甲基取代物或氯取代物) 。,2. 1 結構專一性,11,相對專一性(relative specificity) ：酶對底物要求較低，作用的底物不至一種，對作用底物鍵的兩端的要求程度不同又可分為基團專一性和鍵專一性。,A. 鍵專一性：酶對鍵的兩端無嚴格要求，只要求一定的鍵。如：酯酶(lipase)、二肽酶等。,12,B. 基團專一性：又稱族專一性。酶不但要

9、求底物一定的化學鍵，而且對鍵一端的基團也有嚴格要求。 如：?-D-葡萄糖苷酶不但要求? -糖苷鍵，并要求鍵的一端必須有葡萄糖殘基，而對另一端基團無嚴格要求，可水解蔗糖和麥芽糖。,13,幾乎所有的酶對于立體異構體都具有高度的專一性。酶對底物的立體構型的特異要求，可分為旋光異構專一性和幾何異構專一性。旋光異構專一性 當?shù)孜镉行猱悩嬻w時，酶只作用其中的一種。如L-AA氧化酶只作用于L-AA 、L-乳酸脫氫酶的

10、底物只能是L型乳酸，而不能是D型乳酸。,2. 2 立體異構專一性,14,例如乳酸脫氫酶是具有立體異構特異性的酶，它能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的可逆反應。,15,L(+)乳酸通過其不對稱C原子上的CH3、COOH及OH基分別與乳酸脫氫酶活性中心的A、B及C三個功能基團結合，故可受酶催化而轉變?yōu)楸帷(-)乳酸由于OH、COOH的空間位置與L(+)乳酸相反，與酶的三個結合基團不能完全配合，故不能與酶結合受其催化。,16,幾何異構專一性：

11、如延胡索酸水化酶只催化延胡索酸即反-丁烯二酸水合生成蘋果酸及其逆反應，而不催化順-丁烯二酸。,17,18,幾乎所有的酶都是蛋白質，有的是簡單蛋白質，有的是結合蛋白質，具有蛋白質的一切性質。,3. 酶的化學本質,3.1 酶是蛋白質,19,單純酶： 生物活性僅決定于蛋白質部分結合酶 由蛋白質和非蛋白質部分組成的酶 非蛋白部分一般是有機小分子化合物或金屬離子，稱為輔因子,

12、3.2 結合酶和輔因子,20,21,,輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結合疏松，可用透析或超濾的方法除去。,輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結合緊密，不能用透析或超濾的方法除去。,輔助因子按其與酶蛋白結合的緊密程度分為：,22,金屬酶(metalloenzyme) 金屬離子與酶結合緊密，提取過程中不易丟失 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所

13、必需，但與酶的結合不甚緊密金屬離子的作用 參與催化反應，傳遞電子； 在酶與底物間起橋梁作用； 穩(wěn)定酶的構象； 中和陰離子，降低反應中的靜電斥力等。,23,,,小分子有機化合物在催化中的作用,24,單體酶 (monomeric enzyme ) 單體酶只有一條多肽鏈，這一類酶很少，一般為水解酶類，相對分子質量為13000～35000 常見的單體酶有

14、：溶菌酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶等,3.3 單體酶、寡聚酶和多酶復合體,根據(jù)酶蛋白分子結構上的特點可分為單體酶、寡聚酶和多酶復合體。,25,寡聚酶(oligomeric enzyme) 寡聚酶由幾個甚至幾十個亞基組成，亞基相同或不同，亞基間以非共價鍵結合，用4 mol／L尿素溶液或其它方法可以把它們彼此分開。 寡聚酶的相對分子質量從35 000到幾百萬。

15、 常見的有：磷酸化酶a和3-磷酸甘油醛脫氫酶等。,26,多酶復合體 (multienzyme system) 多酶復合體是由幾個酶聚合而成的復合體。一般由在系列反應中2~6個功能相關的酶組成，它有利于一系列反應的連續(xù)進行，以提高酶的催化效率，同時便于機體對酶的調控。 多酶復合體相對分子質量都很高，一般都在幾百萬以上。例如丙酮酸脫氫酶復合體（總相對分子質量達460 000）

16、和脂肪酸合成酶復合體。,27,28,1981年T. Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲（tetrahymena）的26S rRNA在無蛋白質存在的情況下，具有自我拼接的催化活性。1983年，S. Altman和N. R. Pace發(fā)現(xiàn)將RNaseP）蛋白質組分除去后，其余的RNA部分具有與全酶相同的催化活性，即可對tRNA前體進行加工。,3.4 核酶,29,把對RNA有催化活性的RNA命名為Ribozyme，譯為核酶； 核酶的具體作用主要有

17、：1. 核苷酸轉移作用。2. 水解反應，即磷酸二酯酶作用。3. 磷酸轉移反應，類似磷酸轉移酶作用。4. 脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。5. RNA內切反應，即RNA限制性內切酶作用。已發(fā)現(xiàn)幾十種Ribozyme。,30,三. 酶的分類和命名,氧化還原酶 Oxidoreductase 氧化-還原酶催化氧化-還原反應。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。

18、 如乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應。,1. 酶的分類,根據(jù)酶所催化的反應類型，按照國際酶學委員會，將酶分為六大類：,31,轉移酶 Transferase 轉移酶催化基團轉移反應，即將一個底物分子的基團或原子轉移到另一個底物的分子上。 例如， 谷丙轉氨酶催化的氨基轉移反應。,32,水解酶 Hydrolase 水解酶催化底物的加水分解反應。 主要

19、包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶催化的脂的水解反應,33,裂解酶 Lyase 裂解酶催化從底物分子中移去一個基團或原子形成雙鍵的反應及其逆反應。 主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反應。,34,異構酶 Isomerase 異構酶催化各種同分異構體的相互轉化，即底物分子內基團或原子的重排

20、過程。 例如，6-磷酸葡萄糖異構酶催化的反應。,35,合成酶 Ligase or Synthetase 合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應。這類反應必須與ATP分解反應相互偶聯(lián)。 A + B + ATP + H-O-H ===A ? B + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反應 丙酮酸 + CO2

21、 ? 草酰乙酸,36,每個酶都有一個有四個數(shù)字組成的編碼,37,系統(tǒng)名稱包括底物名稱、構型、反應性質，最后加一個酶字。例如， 習慣名稱: 谷丙轉氨酶 系統(tǒng)名稱: 丙氨酸：?-酮戊二酸氨基轉移酶,2. 酶的命名,2.1 系統(tǒng)命名法,38,根據(jù)其催化底物來命名：蛋白酶、淀粉酶根據(jù)所催化反應的性質來命名： 脫氫酶、轉氨酶、脫羧酶結合上述兩個原則來命名：

22、 乳酸脫氫酶、草酰乙酸脫羧酶有時在這些命名基礎上加上酶的來源或其它特點： 胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,2.2 習慣命名法:,39,四. 酶的作用機理,1. 酶的催化作用及分子活化能,40,活化態(tài)與常態(tài)之間的能量差，也就是分子由常態(tài)轉變?yōu)榛罨癄顟B(tài)（分子過渡態(tài)）所需的能量就成為活化能酶催化作用的本質：降低反應活化能,,41,,Enzyme Stabilizes Transiti

23、on State,,,,S,P,ES,EST,EP,ST,,Energy change,Energy required (no catalysis),Energy decreases (under catalysis),What’s the difference?,T = Transition state,42,2. 中間產(chǎn)物學說,,+,P,+,,,,Steady State Theory,In steady state, the pr

24、oduction and consumption of the transition state proceed at the same rate. So the concentration of transition state keeps a constant.,S,E,E,43,中間產(chǎn)物學說的證據(jù)：電子顯微鏡觀察到了核酸聚合酶與核酸結合而成的復合物；根據(jù)酶和底物反應前后的光譜變化，可證明中間產(chǎn)物的存在；D-氨基酸氧化酶與

25、D-氨基酸結合而成的復合物已被分離、結晶出來。,44,活性中心是指酶分子中直接和底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位，由結合部位和催化部位所組成。結合部位： 由有一定特性的基團組成，一定的底物靠此部位結合到酶分子上，此部位決定酶的專一性。催化部位：由一些參與催化反應的基團組成，起催化作用，底物分子中的化學鍵在此部位被打斷或形成新鍵，從而發(fā)生一定的化學變化，此部位決定酶的催化高效性。,3. 酶的活性部位和必需集團,45,46,酶分子

26、中與酶活性有關的基團稱為酶的必需基團(essential group)。它是酶分子中表現(xiàn)催化活力所必需的部分，包括活性中心和活性中心以外的對維持活性中心空間構象所必需的一些基團。,47,4. 酶與底物結合形成中間絡合物的方式（理論）,4.1 鎖鑰假說(lock and key hypothesis)：,認為整個酶分子的天然構象是具有剛性結構的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結合如同一把鑰匙對一把鎖一樣,解釋了酶的立體異構專一性；但不能

27、解釋酶的活性中心既適合可逆反應的底物，又適合可逆反應的產(chǎn)物。,48,該學說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀,4.2誘導契合假說（induced–fit hypothesis):,49,誘導契合學說的要點,酶有其原來的形狀，不一定一開始就是底物的模板底物能誘導酶蛋白的形狀發(fā)生一定變化（專一性結合）當酶的形狀發(fā)生變化后，就使得其中的催化基團形成正確的排列。在酶反應過程中，酶活性中心構象的變

28、化是可逆的。即酶與底物結合時，產(chǎn)生一種誘導構象，反應結束時，產(chǎn)物從酶表面脫落，酶又恢復其原來的構象。,50,鄰近效應：在酶促反應中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應定向效應：當專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導酶分子構象發(fā)生改變，同時使反應基團之間的分子軌道以正確方向嚴格定位，使酶促反應易于進行。 這兩種效應

29、使酶具有高效率和專一性特點,5. 使酶具有高催化效率的因素,5.1 鄰近效應和定向效應,51,52,5.2 “張力”和“變形”,底物與酶結合誘導酶的分子構象變化，變化的酶分子又使底物分子的敏感鍵產(chǎn)生“張力”甚至“形變” ，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，降低了反應的活化能，有助于過渡態(tài)的中間產(chǎn)物形成,53,54,廣義酸－堿催化是指通過質子酸提供部分質子，或是通過質子堿接受部分質子的作用，達到降低反應活化能的過程酶活性部位

30、上的某些基團可以作為良好的質子供體或受體對底物進行酸堿催化His的咪唑基，解離常數(shù)為6.0。在中性條件下以兼性離子存在，既可以作質子供體，也可以作質子受體，是最有效、最活潑的一個催化功能基團,5.3 酸堿催化,55,催化劑通過與底物形成反應活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應活化能降低，從而提高反應速度的過程，稱為共價催化。酶中參與共價催化的基團主要包括以下親核基團： His 的咪唑基，Cys 的巰基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等；

31、親電子基團：H+ 、Mg2+、 Mn2+ 、Fe3+某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用,5.4 共價催化,56,酶活性中心內相對地說是非極性的，也就是說酶的催化基團被低介電環(huán)境所包圍，在某些情況下，還可能排除高極性的水分子。這樣，底物分子的敏感鍵和酶的催化基團之間就會有很大的反應力，這是有利于酶的加速反應。,5.5 酶活性中心是低介電區(qū)域,57,不同的酶，其主要作用的因素可能是不同的，可能受一種或幾種因素

32、的影響,58,6. 胰凝乳蛋白酶,胰凝乳蛋白酶是一個絲氨酸蛋白酶，活性中心的ＡＡ殘基：Asp102 His57 Ser195,是研究的最早、最徹底的一個酶功能：動物小腸中催化蛋白質的水解,,59,Asp102,His57,Ser195,Catalytic Triad,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A1,,,,O,Check substrate specificity,60,Asp102,His

33、57,Ser195,H,,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A2,O,,First Transition State,61,H,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism A3,O,,Acyl-Enzyme Intermediate,,,62,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D1,O,,,Acyl-Enzyme W

34、ater Intermediate,63,,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D2,O,H,Second Transition State,,,64,H,,,,Chymotrypsin Catalytic Mechanism D3,O,,Deacylation,,65,66,類似與胰凝乳蛋白酶作用機制的還有：胰蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等。,67,沒有催化活性的酶的前體稱為酶原。如：胰蛋

35、白酶原、凝血酶原等。酶原在一定條件下轉變成有活性的酶的過程稱為酶原的激活。 酶原的激活過程常伴有酶蛋白一級結構的改變： 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 + N端6肽片段,7. 酶原激活,,胰蛋白酶/腸激酶,68,69,70,71,概念 研究各種因素對酶促反應速度的影響，并加以定量的闡述。影響因素：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。,※ 研究一種因素的影響時，其余各因

36、素均恒定。,五. 酶促反應動力學,72,測定單位時間內底物的消耗量測定產(chǎn)物的生成量（相對準確）,1. 酶反應速度的測量,73,底物濃度降低、產(chǎn)物濃度增加逐漸促進了逆反應、酶本身的失活研究酶反應速度以酶促反應的初速度為準,74,在底物過量，一定溫度和pH下，酶促反應速度與酶的濃度呈正比。酶濃度對速度的影響機理：酶濃度增加，[ES]也增加，而V=k[ES]，故反應速度增加。,2. 酶濃度對酶作用的影響,75,3. 底物濃度對酶作用的

37、影響和米氏方程,3.1 底物濃度對酶促反應速度的影響,76,,,,,,,,,,Increase Substrate Concentration,,,,,,,,,S+E↓P,(in a fixed period of time),77,78,中間絡合物假說,79,,Constant ES Concentration at Steady State,,,,,,S,P,E,ES,Juang RH (2004) BCbasics,80,

38、1913年，德國化學家Michaelis和Menten根據(jù)中間產(chǎn)物學說對酶促反應的動力學進行研究，推導出了表示整個反應中底物濃度和反應速度關系的著名公式，稱為米氏方程。1925年，Brigg和Haldane對米氏方程的基本原理加以補充和發(fā)展，提出“穩(wěn)態(tài)假說”。,3.2 米氏方程,81,Km — 米氏常數(shù)Vmax — 最大反應速度,82,測定的速度為反應的初速度，即[S]消耗>[E]，[Et]=[ES]穩(wěn)態(tài)的存在,米氏方

39、程的推導：,83,根據(jù)中間產(chǎn)物學說，酶促反應分為兩步,84,85,86,Km值的推導,當 V= Vmax / 2 時,,,Km＝[S],∴Km值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是mol/L。,87,酶的一個重要的特征物理常數(shù)Km值表示酶與底物之間的親和程度Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值,3.3 米氏常數(shù)Km的意義,Km等于酶促反應速度為最大反應

40、速度一半時的底物濃度。,88,Km最小的底物大多數(shù)是此酶的天然底物 如：己糖激酶對葡萄糖的Km 1.5mmol/L 對果 糖的Km 28mmol/L 所以葡萄糖為最適底物,89,,,,,Km: Affinity with Substrate,,,,,S2,S1,S3,,,S1 S2 S3,Vmax,1/2,When using differ

41、ent substrate,Affinity changes,,,,,90,測定Km和V的方法很多，最常用的是Lineweaver–Burk的作圖法 — 雙倒數(shù)作圖法。,3.4 Km值與Vmax值的測定,91,92,An Example for Enzyme Kinetics (Invertase),,,,,Vmax,Km,,,,Double reciprocal,Direct plot,1) Use predefined amount

42、 of Enzyme → E,2) Add substrate in various concentrations→ S (x 軸),3) Measure Product in fixed Time (P/t)→ vo (y 軸),4) (x, y) plot get hyperbolic curve, estimate→ Vmax,5) When y = 1/2 Vmax calculate x ([S]) → Km,,

43、,,1/2,93,,,A Real Example for Enzyme Kinetics,Data,no,1234,0.250.501.02.0,0.420.720.800.92,Absorbance,v (mmole/min),[S],0.210.360.400.46,(1) The product was measured by spectroscopy at 600 nm for 0.05 per mmo

44、le(2) Reaction time was 10 min,1/S,1/v,4210.5,2.081.561.351.16,→→ → →,Direct plot,Double reciprocal,,94,例1：下列數(shù)據(jù)是對酶促反應s→p的記錄：[s](molL-1) v(nmolL-1min-1)6.25×10-6 15.07.50×10-5

45、 56.251.00×10-4 601.00×10-3 74.91.00×10-2 751.00×10-1 75求（1）Vmax和Km (2) [s]=2.5×10-5和[s]=2.00×10-1時v等于多大。,95,例2：下列數(shù)據(jù)是對酶促反應s

46、→p的記錄：[s](umolL-1) v(umol·min-1)0.1 0.2710.0 20.060.0 80.0200 1201000 15

47、01500 1602000 160求（1）Vmax和Km (2) [s] =1600時游離酶的濃度多大？,96,最適pH,4. pH對酶作用的影響,97,過酸 過堿影響酶蛋白的構象，導致失活影響底物的解離狀態(tài)影響酶分子的解離狀態(tài)影響酶分子基團的解離而影響酶活性中心構象,pH影響酶作用的原因：,98,雙重影響 溫度升高，酶促反

48、應速度升高；溫度升高10oC, 反應速度增加一倍；（Q10） 由于酶的本質是蛋白質，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應速度降低。,5. 溫度對酶作用的影響,99,最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應速度最快時的環(huán)境溫度。 溫血動物：35～40℃ Taq DNA聚合酶：70～75℃ ，可耐受100℃高溫。此酶是從水生棲熱菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性D

49、NA聚合酶，用于PCR反應。,100,101,低溫的作用 : 貯存生物制品、菌種等 低溫時由于活化分子數(shù)目減少，反應速度降低，但溫度升高后，酶活性又可恢復。 臨床上的低溫麻醉 減少組織細胞的代謝程度，使機體耐受手術時氧和營養(yǎng)物質的缺乏。,102,激活劑(activator):使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|。? 必需激活劑

50、 (essential activator)? 非必需激活劑 (non-essential activator),6. 激活劑對酶作用的影響,103,無機離子 金屬離子：K+、Na+、 Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、 Se3+、Co2+、Fe2+ 陰離子： Cl-、Br-有機分子 還原劑：抗壞血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽 金屬螯合劑：EDTA,10

51、4,這些離子可與酶分子上的氨基酸側鏈基團結合，可能是酶活性部位的組成部分，也可能作為輔酶或輔基的一個組成部分起作用；一般情況下，一種激活劑對某種酶是激活劑，而對另一種酶則起抑制作用；對于同一種酶，不同激活劑濃度會產(chǎn)生不同的作用。,105,酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白變性的物質稱為酶的抑制劑。區(qū)別于酶的變性 抑制劑對酶有一定選擇性 引起變性的因素對酶沒有

52、選擇性,7. 抑制劑對酶作用的影響,106,酶的抑制劑一般具備兩個方面的特點：在化學結構上與被抑制的底物分子或底物的過渡狀態(tài)相似。能夠與酶的活性中心以非共價或共價的方式形成比較穩(wěn)定的復合體或結合物。,107,抑制作用的類型,不可逆性抑制 (irreversible inhibition),可逆性抑制 (reversible inhibition)：,競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制 (

53、non-competitive inhibition)反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition),108,抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團相結合，使酶失活。如有機磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。,7.1 不可逆性抑制作用,109,有活化作用的不可逆抑制劑： 這類抑制劑以潛伏狀態(tài)存在，當它與酶的活性中心結合以后，就被激活成有抑制活性的抑制劑。在反應中，酶激活了這種無活力的、潛伏態(tài)的不可逆抑制劑，而自身的活力

54、完全喪失。這種抑制劑可以看作酶的“自殺性底物”。,110,抑制劑與酶的結合是可逆的，抑制劑可用透析、超濾等方法除去，從而恢復酶的活性。根據(jù)抑制劑與酶的關系: 競爭性抑制 非競爭性抑制 反競爭性抑制,7.2 可逆性抑制作用,111,7.2.1 競爭性抑制,,112,某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。當抑制劑與活性中心結合后，底物被排斥在反應中心之外，其結果是酶促反應被

55、抑制了。竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。,113,114,競爭性抑制的米氏方程,115,116,競爭性I往往是酶的底物結構類似物；抑制劑與酶的結合部位與底物與酶的結合部位相同—— 酶的活性中心抑制作用可以被高濃度的底物減低以致消除；(表觀）Km值增大，Vm值不變；在雙倒數(shù)圖上表現(xiàn)為： 競爭性抑制和無抑制的直線在縱軸上交于一點； 競爭性抑制直線斜率增大；

56、 競爭性抑制直線在橫軸上的交點右移；,117,118,119,7.2.2 非競爭性抑制,,120,酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質并不是與底物競爭與活性中心的結合，所以稱為非競爭性抑制劑。某些金屬離子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能與酶分子的調控部位中的-SH基團作用，改變酶的空間構象，引起非競爭性抑制。非竟爭性抑制不能通過增大底物濃度的方法來消除。,121,122

57、,123,非競爭性抑制的米氏方程,有非競爭性抑制劑存在時，V值減小(1+[I]/Ki)倍，且V值隨[I]的增高而降低；Km值不變。,124,125,7.2.3 反競爭性抑制,,126,酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合，引起酶活性下降。,127,128,有反競爭性抑制劑存在時，Km和V值均減小(1+[I]/Ki)倍，且都隨[I]的增高而降低。,反競爭性抑制的米氏方程,129,130,Enzyme Inhibition (Mechan

58、ism),Competitive,Non-competitive,Uncompetitive,E,E,,,,,,,,Different site,Compete for active site,Inhibitor,Substrate,Cartoon Guide,Equation and Description,[I] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [

59、S] overcomesInhibition by [I].,[I] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [I] inhibition.,[I] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [I].,X,131,,Enzyme Inhibiti

60、on (Plots),,,,,,,,,,Vmax,Km,Km’,[S], mM,vo,I,I,Vmax unchangedKm increased,Vmax decreasedKm unchanged,Both Vmax & Km decreased,,,I,= Km’,,132,133,六. 酶的調節(jié),134,一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結合，使酶構象改變，從而改變酶的催化活性，此種調節(jié)方式稱別構調節(jié)

61、。 別構酶 (allosteric enzyme) 別構部位 (allosteric site),1.2 別構酶,1. 酶活性的調節(jié),1.1 酶原與酶原的激活,135,別構酶的特點：一般是寡聚酶，由多亞基組成，包括催化部位和調節(jié)（別構）部位；具有別構效應。指酶和一個配體（底物，調節(jié)物）結合后可以影響酶和另一個配體（底物）的結合能力。不符合米氏方程，呈S型曲線,136,137,138,139,,,Mechanism

62、 and Example of Allosteric Effect,A,I,,X,X,X,R = Relax(active),T = Tense(inactive),Allosteric site,Homotropic(+)Concerted,Heterotropic(+)Sequential,Heterotropic(-)Concerted,Allosteric site,Juang RH (2004) BCbasic

63、s,140,1.3 酶的共價修飾調節(jié),141,142,143,144,2. 酶含量的調節(jié),145,146,3. 同工酶,147,148,149,150,七. 酶的活力測定及分離提純,1. 酶活力的測定,151,152,153,154,Turn Over Numbers of Enzymes,Catalase H2O2,Carbonic anhydrase HCO3-,Acetylcholinesterase Ace

64、tylcholine,40,000,000,400,000,140,000,b-Lactamase Benzylpenicillin,2,000,Fumarase Fumarate,800,RecA protein (ATPase) ATP,0.4,Enzymes,Substrate,kcat (s-1),The number of product transformed from substrate by one

65、 enzyme molecule in one second,155,Enzyme Kinetics,Km,Vmax,&,Bi-substrate reaction alsofollows M-M equation, butone of the substrate shouldbe saturated when estimate the other,Affinity withsubstrate,Maximumvelo

66、city,Inhibition,Activity,Observe vo change under various [S], resulted plotsyield Vmax and Km,,,,,,,156,2. 酶的分離提純,157,Basic Principles of Protein Purification,Ammonium sulfate fractionation,,Organelle,,Homogeni

67、zation,Nucleic acid,Carbohydrate,(Lipid),Size,Charge,Polarity,Affinity,Small molecule,Cell Debris,,Protein,Amino acid, Sugar,Nucleotides, etc,Gel filtration,SDS-PAGE,Ultrafiltration,Ion exchange,Chromatofocusing,D

68、isc-PAGE,Isoelectric focusing,Reverse phasechromatography,Salting-out,Affinitychromatography,Hydroxyapatite,158,159,八. 酶工程簡介,1. 酶工程簡介,160,酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反應器中，將相應的原料轉化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學理論與化工技術的交叉技術，它的應用主要集中于食品工業(yè)、