生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

1、生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一 糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)一和二）實(shí)驗(yàn)二 氨基酸的分離鑒定--紙層析法（7）實(shí)驗(yàn)三 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)（8）實(shí)驗(yàn)四 酶的特性（18）實(shí)驗(yàn)五 脂肪碘值的測(cè)定(5)實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng)(9)實(shí)驗(yàn)七 米氏常數(shù)的測(cè)定(20)實(shí)驗(yàn)八 維生素C的定量測(cè)定(23),實(shí)驗(yàn)課是提高教學(xué)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。通過實(shí)驗(yàn)鞏固理論知識(shí)，訓(xùn)練基本操作，培養(yǎng)獨(dú)立工作的能力，為了保證實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)注意以下

2、幾點(diǎn)：,實(shí)驗(yàn)室規(guī)則及安全、衛(wèi)生教育,1、每次實(shí)驗(yàn)前必須詳細(xì)預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)講義，明確實(shí)驗(yàn)原理及操作步驟，并在記錄本上擬出操作時(shí)的注意事項(xiàng)。2、實(shí)驗(yàn)時(shí)自覺遵守課堂紀(jì)律，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作，既要獨(dú)立操作又要與其他同學(xué)配合。3、實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟及試劑用量進(jìn)行操作，不能任意變更。不熟悉的儀器和設(shè)備，應(yīng)先請(qǐng)老師講解后使用，切勿隨意亂動(dòng)。,4、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)，必須隨時(shí)把觀察得到的現(xiàn)象和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，如實(shí)地記錄在記錄本上，不得記錄在其他紙上，要養(yǎng)成作原始

3、記錄的良好習(xí)慣。 5、實(shí)驗(yàn)時(shí)如有問題發(fā)生，應(yīng)首先用自己學(xué)過的知識(shí)，獨(dú)立思考加以解決，培養(yǎng)獨(dú)立分析問題和解決問題的能力，如自己不能解決，可與指導(dǎo)老師共同討論研究，提出解決問題的辦法。 6、精心愛護(hù)各種儀器。實(shí)驗(yàn)所需的一般儀器按規(guī)定借領(lǐng)，歸還。完成實(shí)驗(yàn)后應(yīng)將儀器洗凈倒置于實(shí)驗(yàn)柜中并排列整齊。如有損壞或遺失，需要說明原因，經(jīng)指導(dǎo)教師簽名后方可補(bǔ)領(lǐng)，并按規(guī)定賠償。,7、精密貴重儀器每次使用后應(yīng)登記姓名并記錄儀器使用情況。要隨時(shí)保持儀器的清潔

4、。如發(fā)生故障，應(yīng)立即停止使用并報(bào)告指導(dǎo)教師。8、驗(yàn)中所用得玻璃儀器及其它器皿，應(yīng)洗滌干凈，桌面、地面要保持清潔有序，實(shí)驗(yàn)完畢后，所用儀器設(shè)備應(yīng)恢復(fù)原狀。,9、必須遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則：（1）室內(nèi)不得高聲談笑，保持安靜的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。（2）愛護(hù)儀器，不得浪費(fèi)藥品，節(jié)省水電，遵守學(xué)生守則及實(shí)驗(yàn)室安全、衛(wèi)生等制度。（3）公用儀器及試劑瓶用完后應(yīng)及不要移動(dòng)原有的位置。注意瓶塞切勿蓋錯(cuò)，以免污染試劑，用畢后立即放回原處。對(duì)于有害藥品，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定

5、取用。（4）濾紙、火柴棒、碎玻璃等應(yīng)投入廢品袋，切勿丟入水池，以保證下水道暢通。,（5）如用儀器有損壞，立即向指導(dǎo)老師報(bào)告，再行登記。（6）保持實(shí)驗(yàn)室的整齊清潔，個(gè)人所帶與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的東西，如書包等要放在實(shí)驗(yàn)室指定地方，不得亂放在實(shí)驗(yàn)桌上。（7）由學(xué)生輪流值日，值日生要負(fù)責(zé)當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生、安全和服務(wù)性的工作，特別注意打掃水槽中廢棄物。（8）最后一組實(shí)驗(yàn)人員，離開實(shí)驗(yàn)室時(shí)，檢查水、電、門、窗是否關(guān)閉，以保證實(shí)驗(yàn)室安全。（9）如有

6、突發(fā)事件（起火、試劑腐蝕傷人）發(fā)生，不要驚慌失措，應(yīng)妥善處置（使用滅火機(jī)、關(guān)閉電源等）。,實(shí)驗(yàn)一 糖類的性質(zhì)實(shí)驗(yàn),糖類的重要鑒別方法是 Ｍｏｌｉｓｈ反應(yīng)和Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反應(yīng)。糖類、苷類及其他含糖物質(zhì)與α 萘酚和濃硫酸呈紫紅色的環(huán)的反應(yīng)稱為 Ｍｏｌｉｓｈ反應(yīng)，該反應(yīng)可用于糖類和非糖物質(zhì)的鑒別。酮糖糖加入間苯二酚和６ｍｏｌ／Ｌ鹽酸能產(chǎn)生紅色的反應(yīng)稱為Ｓｅｌｉｗａｎｏｆｆ反應(yīng)，該反應(yīng)可用于酮糖和醛糖的鑒別。如己酮糖加入間苯二酚

7、和濃鹽酸，加熱后迅速產(chǎn)生紅色，而同樣條件下己醛糖的反應(yīng)速度要慢得多。,非還原性糖在酸存在下，加熱水解后產(chǎn)生還原性的單糖。淀粉的水解是逐步發(fā)生的，先水解成紫糊精，再水解成紅糊精、無色糊精、麥芽糖，最終水解成葡萄糖。用碘液可以檢查這種水解過程。完全水解后，可用Ｂｅｎｅｄｉｃｔ試劑加以證實(shí)。多糖類遇濃硫酸被水解成單糖，單糖被濃硫酸脫水閉環(huán)，形成糠醛類化合物，在濃硫酸存在下與α萘酚發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，生成紫紅色縮合物。,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解

8、糖類某些顏色反應(yīng)的原理；2、學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類的方法；3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定糖類還原性的方法及 其原理。,二、實(shí)驗(yàn)原理(一)顏色反應(yīng)1. α-萘酚反應(yīng)糖在濃無機(jī)酸（硫酸或鹽酸）作用下，脫水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能與α-萘酚生成紫紅色物質(zhì)。注意：因糠醛及糠醛衍生物對(duì)此反應(yīng)均呈陽(yáng)性，不是糖類的特異反應(yīng)。,O,CHO,-CH2OH,2. 間苯二酚反應(yīng) 在酸作用下，酮糖脫水生成羥甲基糠醛，后者再與間苯二酚

9、作用生成紅色物質(zhì)。此反應(yīng)是酮糖的特異反應(yīng)。因?yàn)槿┨窃谕瑯訔l件下呈色反應(yīng)緩慢，只有在糖濃度較高或煮沸時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，才呈微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。,(二) 還原作用許多糖類由于其分子中含有自由的或潛在的醛基或酮基，因此在堿性溶液中能將銅、鐵、銀等金屬離子還原，同時(shí)糖類本身被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物。糖類這種性質(zhì)常被利用于檢測(cè)糖的還原性及還原糖的定量測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)所用的試劑為斐林試劑和本尼迪克特試劑。它們都是Cu2＋的堿性溶液，能使還原糖氧化而本身

10、被還原成紅色（顆粒大）或黃色（顆粒?。┑腃u2O沉淀。本尼迪克特試劑是改良的斐林試劑。（見P100,101腳注）,三、器材及試劑1、器材：試管、試管架、滴管、水浴鍋（或電爐）2、試劑： 1%葡萄糖溶液， 1%果糖溶液， 1%蔗糖溶液， 1%淀粉， 1%麥芽糖溶液， 0.1%糠醛溶液，

11、 濃硫酸， 莫氏試劑， 塞氏試劑， 斐林試劑， 本尼迪克特試劑,四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、α-萘酚反應(yīng)1%葡萄溶液　1%果糖溶液　各加1ml　　 　★各加2滴　　　 ★各加1ml 　1%蔗糖溶液　　　　　　　　　莫氏試劑　　 濃硫酸1%淀粉溶液　　　　

12、 0.1%糠醛溶液,,,,,5支試管,混勻,觀察記錄各管顏色,Molisch反應(yīng)（?-萘酚反應(yīng)）,,,,,濃H2SO4,界面：顯色-------,鑒定：所有的糖類均可顯色,2. 間苯二酚反應(yīng)　　 1%葡萄糖溶液 各加0.5ml　　　 各加5ml　　　　　　　　 1%果糖溶液　　　　　　　　　　 賽氏試劑 1%

13、蔗糖溶液,,,,,,3支試管,混 均,同時(shí)置沸水浴中,觀察記錄各管顏色,3、糖與斐林試劑的反應(yīng)1）檢驗(yàn)試劑：,1ml斐林試劑或1ml本尼迪克特試劑,4ml蒸餾水,1支試管,加熱煮沸,觀察現(xiàn)象,,,,＋,2）實(shí)驗(yàn)過程 　2ml斐林試劑　 1%葡萄糖溶液 各加 1ml 　　 　 1%果糖溶液 　　　　

14、 或 1%蔗糖溶液　　　　　　 1%麥芽糖溶液　 2ml本尼迪克特 1%淀粉溶液 試劑,,,,,5支試管,觀察記錄各管顏色,置沸水浴中加熱,＋,,取出冷卻,五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（P99,102）六、實(shí)驗(yàn)思考題： 1. 可用何種顏色反應(yīng)鑒別酮糖的存在？ 2. α-萘酚反應(yīng)的原理是什么？ 3. 斐林試

15、劑、本尼迪克特試劑檢驗(yàn)糖的 原理是什么？七、預(yù)習(xí)：　　P109 實(shí)驗(yàn)二,實(shí)驗(yàn)二 脂肪碘值的測(cè)定,,實(shí)驗(yàn)時(shí)取樣多少?zèng)Q定于油脂樣品的碘值。可參考表1與表2：,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)和掌握測(cè)定脂肪碘值的原理和方法。 2、了解和學(xué)習(xí)空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)的原理和方法,教材第6、7頁(yè),二、實(shí)驗(yàn)原理碘值（價(jià)）是指100g脂肪在一定條件下吸收碘的克數(shù)。碘值是鑒別脂肪的一個(gè)重要常數(shù)，可用以判斷脂肪所含

16、脂肪酸的不飽和程度。脂肪中常含有不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，能與鹵素起加成作用而吸收鹵素。,常用碘與脂肪中不飽和脂肪酸的雙鍵起加成作用。脂肪的不飽和程度越高，所含的不飽和脂肪酸越多，與其雙鍵起加成作用的碘量就越多，碘值就越高。故可用碘值表示脂肪的不飽和度。 I2　+　－CH=CH－　　　　?。瑿HI－CHI－,,本實(shí)驗(yàn)用溴化碘(Hanus試劑)代替碘。用一定量(必須過量)溴化碘和待測(cè)的脂肪作用后，用硫代硫

17、酸鈉滴定的方法測(cè)定溴化碘的剩余量，然后計(jì)算出待測(cè)脂肪吸收的碘量，求得脂肪的碘值。,加成作用：IBr　+?。瑿H=CH－　　　　?。瑿HI－CHBr－ 剩余溴化碘中碘的釋放： 　IBr + KI KBr + I2再用硫代硫酸鈉滴定釋放出來的碘： I2 +2Na2S2O3 2Na2S4O6+2NaI,,,,三、器材及試劑1、器材： 碘瓶，量筒，滴定

18、管，吸量管，滴管，分析天平2、試劑： 花生油，Hanus試劑, 四氯化碳，10%碘化鉀溶液 0.05%mol/L 硫代硫酸鈉溶液， 1%淀粉溶液,四、實(shí)驗(yàn)步驟0.3-0.4g油兩份 潔凈碘瓶 加入10ml四氯化碳 輕輕振動(dòng) 加入Hanus試劑25ml　　塞好瓶塞，并在塞子與瓶口間加入數(shù)滴KI溶液 混勻 置暗處30分鐘 打開瓶塞，將KI流入瓶?jī)?nèi) 　加入KI 10ml和

19、蒸餾水50ml,將瓶塞和瓶頸上的液體沖入瓶?jī)?nèi) 混勻 用0.1ml/L的Na2S2O3滴定至淡黃色 加入1%淀粉溶液約1ml繼續(xù)滴定 至接近滴定終點(diǎn)(藍(lán)色極淡) 加塞用力振蕩 再滴至滴定終點(diǎn)（水層與非水層全部都無色） 另外再做一份空白實(shí)驗(yàn)。(除不加樣品外，其它操作同樣品實(shí)驗(yàn)。),,,,,,,,,,,,,,,附  注   （1）碘瓶必須潔凈、干燥，否則油中含有水分，引起

20、反應(yīng)不完全。   （2）加碘試劑后，如發(fā)現(xiàn)碘瓶中顏色變淺褐色時(shí)，表明試劑不夠，必須再添加10～15 mL試劑。  （3）如加入碘試劑后，液體變濁，這表明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。（4）將近滴定終點(diǎn)時(shí)，用力振蕩是本滴定成敗的關(guān)鍵之一，否則容易滴加過頭或不足。如震蕩不夠，CCl4展會(huì)出現(xiàn)紫或紅色，此時(shí)應(yīng)用力振蕩，使碘進(jìn)入水層。（5）淀粉溶液不宜加得過早，否則滴定值偏高。,五、

21、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄 1、原始數(shù)據(jù)記錄 1）花生油的質(zhì)量 W值 2）Na2S2O3摩爾濃度 C值,2）滴定結(jié)果記錄： A為滴定空白所消耗的Na2S2O3溶液mL數(shù)；B為滴定樣品所消耗的Na2S2O3溶液mL數(shù)；c為Na2S2O

22、3溶液的摩爾濃度。最后求出平均碘值。,,六、思考題： 1、何謂碘值？具有什么意義？ 2、何謂空白溶液和空白實(shí)驗(yàn)？空白實(shí)驗(yàn)有何意義？七、預(yù)習(xí)：P122 實(shí)驗(yàn)三 氨基酸的分離鑒定--紙層析法,一、層析技術(shù)簡(jiǎn)介,層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同

23、速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。,層析法是近代生物化學(xué)最常用的分析方法之一，運(yùn)用這種方法可以分離性質(zhì)極為相似，而用一般化學(xué)方法難以分離的各種化合物，如各種氨基酸、核苷酸、糖、蛋白質(zhì)等。,二、層析的分類,1、按分離相狀態(tài)分類 ： 根據(jù)層析過程中的固定相和流動(dòng)相進(jìn)行分類，大致可以分以下幾類 ：（1）氣相層析是以氣體為流動(dòng)相的層析方法，稱之為氣相層析。根據(jù)固定相的性質(zhì)不同又可以分為氣-固層析(GSC)和氣-液層析(GLC)。前者是指載體表面含有

24、許多吸附基團(tuán)的固體吸附介質(zhì)，后者是指載體表面涂有一層薄薄液體分子制成的介質(zhì)。,（2）液相層析是以液體為流動(dòng)相的層析方法，稱之為液相層析。同理，根據(jù)固定相的性質(zhì)不同又可以把液相層析分為液-固層析(LSC)和液-液層析(LLC)。液相層析的固定相性質(zhì)與氣相層析相近。（3）超臨界層析是以流體為流動(dòng)相的層析方式，稱為超臨界層析(SFC)。它是利用流動(dòng)相溶劑分子的氣態(tài)和液態(tài)臨界點(diǎn)的條件下進(jìn)行分離的，這種分離方法更具專一性。,2、按層析的分離

25、機(jī)理分類 （1）排阻層析利用凝膠層析介質(zhì)(固定相)交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。,（2）離子交換層析利用固定相球形介質(zhì)表面活性基團(tuán)經(jīng)化學(xué)鍵合方法，將具有交換能力的離子基團(tuán)在固定相上面，這些離子基團(tuán)可以與流動(dòng)相中離子發(fā)生可逆性離子交換反應(yīng)而進(jìn)行分離的方法，稱之為離子交換層析。,（3）吸附層析利用吸附層析介

26、質(zhì)表面的活性分子或活性基團(tuán)，對(duì)流動(dòng)相中不同溶質(zhì)產(chǎn)生吸附作用，利用其對(duì)不同溶質(zhì)吸附能力的強(qiáng)弱而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為吸附層析。,（4）分配層析,被分離組分在固定相和流動(dòng)相中不斷發(fā)生吸附和解吸附的作用，在移動(dòng)的過程中物質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配。利用被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為分配層析。,（5）親和層析 在固定相載體表面偶聯(lián)具有特殊親和作用的配基，這些配基可以與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子發(fā)生可逆的特異性

27、結(jié)合而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為親和層析。,（6）金屬螯合層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。,（7）疏水層析,利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性配基與流動(dòng)相中的一些疏水分子發(fā)生可逆性結(jié)合而進(jìn)行分離的方法，稱之為疏水層析。,（8）反向?qū)游?

28、 利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性較強(qiáng)的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發(fā)生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相來分離不同極性的物質(zhì)的方法，稱之為反相層析。 （9）聚焦層析 利用固定相載體上偶聯(lián)的載體兩性電解質(zhì)分子，在層析過程中所形成的pH梯度，并與流動(dòng)相中不同等電點(diǎn)的分子發(fā)生聚焦反應(yīng)進(jìn)行分離的方法，稱之為聚焦層析。,（10）灌注層析 利用剛性較強(qiáng)的層析介質(zhì)顆粒中具有的不同

29、大小貫穿孔與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子分子量的差異進(jìn)行分離的方法，稱之為灌注層析。,實(shí)驗(yàn)三 氨基酸的分離鑒定--紙層析法,氨基酸的分離鑒定--紙層析法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法,二、實(shí)驗(yàn)原理紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。(其原理參見P33)層析溶劑由有機(jī)溶劑(或稱有機(jī)相，是流動(dòng)的、被水飽和的，構(gòu)成流動(dòng)相)和水(通常是被結(jié)合在濾紙上，構(gòu)成固定相)組成。(P34紙層析原理：在紙上，水

30、被吸附在纖維素的纖維之間,紙層析原理：在紙上，水被吸附在纖維素的纖維之間形成固定相，由于纖維素與水的氫鍵作用，使水不易擴(kuò)散，并能與跟水混合的溶劑(有機(jī)相)形成類似不相混合的兩相。當(dāng)有機(jī)相沿紙流動(dòng)經(jīng)過層析點(diǎn)時(shí)，層析點(diǎn)上的溶質(zhì)就在水相和有機(jī)相之間進(jìn)行分配，有一部分溶質(zhì)離開原點(diǎn)隨有機(jī)相移動(dòng)而進(jìn)入無溶質(zhì)的區(qū)域，這時(shí)又重新進(jìn)行分配，一部分溶質(zhì)從有機(jī)相進(jìn)入水相。當(dāng)有機(jī)相不斷流動(dòng)時(shí)，溶質(zhì)就沿著有機(jī)相流動(dòng)的方向移動(dòng)，不斷進(jìn)行分配。溶質(zhì)中各組分的分配系數(shù)

31、不同，移動(dòng)速率也不同，因而可以彼此分開。,物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移值）來表示的： 原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離 Rf＝ 　　　　 原點(diǎn)到溶劑前沿的距離在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)，Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量、展層方式、層析溫度和pH等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。,,三、器

32、材及試劑1、器材：層析缸（或標(biāo)本缸），毛細(xì)管，噴霧器，電吹風(fēng)，培養(yǎng)皿，層析濾紙(質(zhì)地必須均一、平整及厚薄均勻，要有一定的強(qiáng)度。新華1號(hào)或3號(hào)濾紙(或Whatman 1號(hào)或3號(hào)濾紙)2、試劑：0.5%的賴氨酸，0.5%的脯氨酸，0.5%的纈氨酸，0.5%的苯丙氨酸，0.5%的混合氨基.酸，顯色劑，擴(kuò)展劑,四、實(shí)驗(yàn)步驟1．取擴(kuò)展劑約5ml置于小燒杯中做平衡溶劑，然后將小燒杯置于密閉的層析缸中（或標(biāo)本缸）。2．取層析濾紙（長(zhǎng)22c

33、m，寬14cm）一張。在紙的一端距邊緣2-3cm 處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm 作一個(gè)記號(hào)(“×”型而不是“.”型)，共作5個(gè)記號(hào)作為點(diǎn)樣點(diǎn)；另外，沿展層方向在濾紙兩邊距邊緣約0.5-1cm處對(duì)稱地劃兩條直線，分別將其四等分，各取其三個(gè)等分點(diǎn)作為縫線點(diǎn)。,3、點(diǎn)樣 用毛細(xì)管將各種氨基酸樣品分別點(diǎn)在這6個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)位置上(注意速度要快，否則易擴(kuò)散開)，干后再點(diǎn)一次。每點(diǎn)在紙上擴(kuò)散的直徑最大不超過3mm。4．?dāng)U展

34、 用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸，將盛有約20ml擴(kuò)展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中（點(diǎn)樣的一端在下，擴(kuò)展劑的液面需要低于點(diǎn)樣紙1cm）。待溶劑上升15-20cm時(shí)取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或者用吹風(fēng)機(jī)吹干。,5．顯色 用噴霧器均勻噴上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘（100℃）或用熱風(fēng)吹干即可以顯出個(gè)層析斑點(diǎn)。6．計(jì)算各種氨基酸的Rf值五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄,六、思考

35、題：1．何謂紙層析法？2．何謂Rf值？影響Rf值的主要因素是什么？3．怎樣制備擴(kuò)展劑？預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)四 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng)。 P125,實(shí) 驗(yàn) 四 蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接方式。2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3．學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法,二、實(shí)驗(yàn)原理（一）雙縮脲反應(yīng)雙縮脲反應(yīng):尿素加熱至180℃左

36、右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。這可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。,注意:①雙縮脲反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)所特有，許多含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)氨基的物質(zhì)也能發(fā)生此反應(yīng) 如 –CS-NH2，-CH2-NH2，O=C C=O 等。 NH2 NH2②NH3也干擾此

37、反應(yīng)，因?yàn)镹H3與Cu2+可生成暗藍(lán)色的絡(luò)離子( Cu(NH3)42+ ，四氨合銅)。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。,,,,（二）茚三酮反應(yīng)除脯氨酸，羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。,β-丙氨酸、氨和許多一級(jí)胺都呈正反應(yīng) (尿素、馬尿酸和肽鍵上的亞氨基不呈現(xiàn)此反應(yīng)。)因此，雖然蛋白質(zhì)和氨基酸均有茚三酮反應(yīng)，但能

38、與茚三酮呈陽(yáng)性反應(yīng)的不一定是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性定量測(cè)定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。該反應(yīng)十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。,茚三酮反應(yīng)分為兩步：第一步是氨基酸被氧化形成二氧化碳，氨和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮。第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。(此反應(yīng)的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同的pH條件下的顏色深淺不同，

39、酸度過大時(shí)甚至不顯色。),（三）黃色反應(yīng) 含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。(多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，注意苯丙氨酸不易硝化，需加入少量的濃硫酸才有黃色反應(yīng)，該反應(yīng)非常靈敏。),（四）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)考馬斯亮藍(lán)G250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色；當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色

40、。(它染色靈敏度高，比氨基黑高3倍，反應(yīng)速度快，約在2分鐘達(dá)到平衡，在室溫1小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，常用來定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量),三、器材及試劑1、器材：電爐、試管、試管架、吸管、吸管架等2、試劑：尿素, 1%CuSO4溶液， 10%NaOH溶液2%卵清蛋白溶液，0.5%甘氨酸溶液，0.1%茚三酮水溶液，0.1%茚三酮乙醇溶液，0.5%苯酚溶液，濃硝酸，0.3%色氨酸0.3%酪氨酸溶液，考馬斯亮藍(lán)染液。,,四、實(shí)驗(yàn)步驟㈠雙縮脲反應(yīng)取

41、少量尿素結(jié)晶于干燥試管中　 微火加熱熔化 硬化時(shí)停止加熱 冷后，加10%NaOH溶液約1ml 振蕩混勻 加一滴1%CuSO4溶液 再振蕩 觀察記錄另取一只試管 加卵清蛋白溶液約1ml 和10%NaOH溶液約2ml 搖勻 加1%CuSO4溶液2滴 隨加隨搖 觀察記錄,,,,,,,,,,,,,㈡ 茚三酮反應(yīng)(1)取兩支試管 分別加

42、入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液各1ml 再各加0.1%茚三酮水溶液0.5ml 混勻 沸水浴中加熱1～2分鐘 觀察(2)在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液 風(fēng)干 在原處滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液 微火旁烘干顯色 觀察,,,,,,,,㈢ 黃色反應(yīng)向6支試管中分別按下表加入試劑，觀察各試管出現(xiàn)的現(xiàn)象，待各管出現(xiàn)黃色后，與室溫下逐滴加入 10%NaOH溶液至堿性，觀

43、察顏色變化。,㈣ 考馬斯亮藍(lán)反應(yīng) 取2支試管，按下表操作：,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄 見P131-132表六、思考題：通過本實(shí)驗(yàn)?zāi)阏莆樟藥追N鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法？它們的原理是什么？ 七、預(yù)習(xí)：P133實(shí)驗(yàn)五 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng),實(shí)驗(yàn)五 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測(cè)定和沉淀反應(yīng),一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)；2、學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的方法；3、加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)；4、了解沉淀蛋白質(zhì)的

44、幾種方法及其實(shí)用意義；5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。,二、實(shí)驗(yàn)原理(一)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的測(cè)定蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡(見P133圖)。 COOH P (蛋白質(zhì)分子) NH2 COO- C

45、OO- COOH P P P NH2 NH3+ NH3+ 陰離子 兼性離子 陽(yáng)離子 pH>pI pH=pI

46、 pH<pI電場(chǎng)中： 移向陽(yáng)極 不移動(dòng) 移向陰極,,,,,,,,,,,,,+ H+,+ H+,+ OH-,+ OH-,,,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI) ：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液酸堿度的影響，當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng) ，此時(shí)溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同

47、蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)(pI)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測(cè)其溶解度最低(或沉淀量最多)時(shí)的溶液pH值。本實(shí)驗(yàn)借觀察不同pH緩沖液中溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。,(二)蛋白質(zhì)的沉淀及變性 在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可以分為兩類：(1)可逆

48、的沉淀反應(yīng)(不變性，如鹽析作用或低溫作用下用乙醇或丙酮短時(shí)間作用)(2)不可逆的沉淀反應(yīng)(變性，如加熱沉淀與凝固、與重金屬離子或某些有機(jī)酸反應(yīng)等),(注意：蛋白質(zhì)變性后，由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在(如電荷)，并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性),三、器材及試劑1、器材：水浴鍋 溫度計(jì) 容量瓶 錐形瓶 吸管 試管 吸管架 試管架2、試劑： 0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液：1.0mol/L醋酸溶液

49、, 0.1mol/L醋酸溶液，0.01mol/L醋酸溶液，蛋白質(zhì)溶液，pH4.7HAc-NaAc的緩沖溶液，3%硝酸銀溶液，5%三氯乙酸溶液，乙醇，飽和硫酸銨溶液，硫酸銨結(jié)晶粉末，0.1mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L氫氧化鈉溶液，0.05mol/L碳酸鈉溶液，甲基紅溶液，2%氯化鋇溶液,四、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的測(cè)定1、取同樣規(guī)格的試管4支，按下表順序分別精確的加入各試劑，然后混勻。(注意：在測(cè)定等電點(diǎn)實(shí)驗(yàn)中，要求

50、各種試劑的濃度和加入量相當(dāng)準(zhǔn)確),2、向以上各試管加酪蛋白的NaAc溶液 1mL(加一管，搖勻一管)。此時(shí)1，2，3，4管的pH依次為5.9，5.3，4.7，3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度(最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn))。,(二)蛋白質(zhì)的沉淀及變性1、蛋白質(zhì)的鹽析：無機(jī)鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)的濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。(如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽

51、和硫酸銨溶液中才能析出)蛋白質(zhì)溶液5mL于試管中 加5mL飽和硫酸銨 混均靜置數(shù)分鐘倒出少量沉淀 加少量水 觀察是否溶解(？),,,,,,,,,,,,2、重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)(重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物)取蛋白質(zhì)溶液 2mL 于試管中 加3%硝酸銀溶液1-2滴 振蕩 放置片刻 傾去上清液 向沉淀中加入少量水 觀察是否溶解(？),,,,,,,3、某些有機(jī)

52、酸沉淀蛋白質(zhì)(Ph<pI)蛋白質(zhì)溶液2mL于試管中 加5%三氯乙酸溶液1mL 振蕩 放置片刻 觀察現(xiàn)象 傾去上清液 向沉淀中加入少量水 觀察是否溶解(？)4、有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)脫去水化層，降低介電常數(shù))蛋白質(zhì)溶液2mL 乙醇2mL 振蕩 觀察沉淀？,,,,,,,,,,5、乙醇引起的變性與沉淀 取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑：,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)

53、果記錄：見P140-142六、思考題：何謂蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和沉淀反應(yīng)？有何實(shí)用意義？七、預(yù)習(xí)： 實(shí)驗(yàn)六 酶的特性(P169),實(shí)驗(yàn)六 酶的特性,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康募由顚?duì)酶的性質(zhì)的認(rèn)識(shí)二、實(shí)驗(yàn)原理（一）溫度對(duì)酶活力的影響：酶的催化作用受溫度的影響。在最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。(大多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度37℃-40℃，植物酶的最適溫度為50-60℃。)高溫可以使酶失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。,酶對(duì)溫度

54、的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100℃，其活性并無明顯改變，但在100℃的溶液中卻很快地完全失去活性。淀粉被唾液淀粉酶水解的產(chǎn)物有糊精和麥芽糖。淀粉遇碘呈藍(lán)色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色或紅色、不呈色。麥芽糖遇碘也不呈色。因此，在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來判斷。,（二）pH對(duì)酶活性的影響：酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著。不同酶的最適pH值不同。本實(shí)

55、驗(yàn)觀察pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制：酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為唾液淀粉酶的抑制劑。(四)酶的專一性：酶具有高度的專一性。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶和蔗糖酶對(duì)淀粉和蔗糖的作用為例，來說明酶的專一性。(淀粉和蔗糖無還原性。唾液淀粉酶水解淀粉最終生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解生成還原性的葡萄糖和果糖，但不能催化

56、淀粉的水解。用本尼迪克特試劑檢查糖的還原性。),三、器材及試劑1、器材：試管及試管架 恒溫水浴鍋 吸管 滴管 錐形瓶 電爐 石棉網(wǎng) 燒杯 冰塊 塑料盆2．試劑：0.2%淀粉的0.3%氯化鈉溶液(新鮮配制)；0.5%淀粉的0.3%NaCl溶液(新鮮配制)；1%淀粉的0.3%氯化鈉溶液(新鮮配制)；稀釋200倍的唾液(新鮮配制)；KI-I2溶液(用前稀釋10倍)；0.2mol/LNa2HPO4溶液

57、；0.1mol/L檸檬酸溶液；四種pH試紙(pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8)；0.1%的淀粉溶液；1% NaCl溶液；1%CuSO4溶液；1%Na2SO4溶液；2%蔗糖溶液；蔗糖酶溶液,四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）溫度對(duì)酶活力的影響 取3支試管，編號(hào)，按下表加入試劑：,搖勻,,,,1,3號(hào)管,37℃水浴,2號(hào)管,冰水浴,10分鐘,,,,,一半,一半,,加KI-I2,37℃水浴 10分鐘,,,加KI-I2

58、,記錄現(xiàn)象,現(xiàn)象,（二）pH對(duì)酶活性的影響1、配制緩沖液：取4個(gè)50mL錐形瓶，編號(hào)，用吸管按P171表添加0.2mol/L Na2HPO4和0.1mol/l檸檬酸溶液以制備pH5.0-8.0的4種緩沖液（PH5.0、PH5.8、PH6.8、PH8.0）2、過程,取4支試管,編 號(hào),pH緩沖液3mL,0.5%淀粉2 mL,間隔1min加已稀釋200倍的唾液2 mL,混勻,依次于37℃水浴中保溫,每隔1分鐘用白瓷板檢驗(yàn)H6.8的試管

59、淀粉水解程度,各管間隔1min加1-2滴KI-I2溶液,觀察各管顏色變化,,,,,,,,,,2分鐘,顯示棕黃色后,檢驗(yàn)方法:待向第4管加入唾液2min后，每隔1min由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴KI-I2溶液，檢驗(yàn)淀粉水解程度。待混合液變?yōu)樽攸S色時(shí)，向所有試管依次添加1-2滴KI-I2溶液。,(三)唾液淀粉酶的活化和抑制取4支試管，編號(hào)，按下表加入各試劑： 解釋結(jié)果，說明本實(shí)驗(yàn)第3管的意義。

60、(注意：保溫時(shí)間可根據(jù)各人唾液淀粉酶活力調(diào)整。),(四)酶的專一性：1、淀粉酶的專一性(見P174表) (注意：唾液中除含淀粉酶外還含有少量的麥芽糖酶) 2、蔗糖酶的專一性(見P175表，與上表區(qū)別在于37℃恒溫水浴中保溫5min),五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄：見P175-177六、思考題：1、什么是酶的最適溫度和最適 pH？2、什么是酶的活化劑？、什么是酶的抑制劑？與變性劑有何區(qū)別？3、本實(shí)驗(yàn)

61、結(jié)果如何證明酶的專一性？預(yù)習(xí)： 實(shí)驗(yàn)七 米氏常數(shù)的測(cè)定(P181),實(shí)驗(yàn)七 米氏常數(shù)的測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。2、學(xué)習(xí)測(cè)定米氏常數(shù)（Km）的原理和方法。,Vmax［S］,,Km +［S］,,,,1,v,Km,1,1,,Vmax,［S］,Vmax,V=,二、實(shí)驗(yàn)原理 米氏方程:改為雙倒數(shù)式 ： =

62、 · +,,,,1,v,Km,1,1,,Vmax,［S］,Vmax,= · +,Km值是酶的一個(gè)特征常數(shù)，測(cè)定Km值是酶學(xué)研究中的一個(gè)重要方法。雙倒數(shù)作圖法是實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定Km值的最常用的比較方便的方法。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇不同的[S]，測(cè)定相對(duì)應(yīng)的V，求出兩者的倒數(shù)，以1/V對(duì)

63、1/[S]作圖，則得到一斜率為Km/Vmax的直線。將直線外推與橫軸相交，由1/Km=-1/[S]求出Km。,本實(shí)驗(yàn)以胰蛋白酶消化酪蛋白為例，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法測(cè)定Km值。胰蛋白酶是胰液中的一個(gè)酶，它催化蛋白質(zhì)中堿性氨基酸（L-精氨酸和L-賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵水解。水解時(shí)生成自由氨基，因此可以用甲醛滴定法(原理參見P148)判斷自由氨基增加的數(shù)量來追蹤反應(yīng)。,三、器材及試劑1、器材：錐形瓶 堿式

64、滴定管 滴定臺(tái) 蝴蝶夾 吸管 量筒 恒溫水浴鍋2、試劑：pH8.5酪蛋白溶液(10、20、30、40g/ L)；40g/ L胰蛋白酶溶液；純甲醛溶液；酚酞(2.5g/ L乙醇)；標(biāo)準(zhǔn)NaOH(約0.1mol/L)溶液,四、實(shí)驗(yàn)步驟1、6個(gè)小錐形瓶 分別加入2.5mL甲醛溶液和1滴酚酞 分別滴加0.1ml/LNaOH溶液 至混合物呈為微粉紅色(所有瓶中顏色須一致)2、另取一大錐形瓶 加入30mL酪蛋白

65、溶液 37℃水浴保溫10min （同時(shí)胰蛋白酶溶液也37℃水浴中保溫10 min）,,,,,,3、精確地取5mL酶液 加到酪蛋白溶液中，同時(shí)記時(shí) 充分混合 隨即取5mL反應(yīng)混合物(作為0時(shí)樣品) 吹至上述含甲醛的小錐形瓶中 各加入酚酞（1滴酚酞/ml混合液） 用0.1mol/LNaOH滴定至呈微弱但持的粉紅色 在接近終點(diǎn)時(shí)，再加入指示劑(每mLNaOH溶液

66、加入1滴酚酞) 繼續(xù)滴定至終點(diǎn) 記下所消耗NaOH的mL數(shù)4、在2、4、6、8和10min時(shí)分別取出5mL消化樣品，準(zhǔn)確地照上法操作，在每一個(gè)樣品中滴定終點(diǎn)的顏色應(yīng)當(dāng)是一致的，用增加的滴定度對(duì)時(shí)間作圖，測(cè)定初速度。,,,,,,,,,,5、用不同濃度的酪蛋白溶液（10，20，30g/L ，40g/L ）測(cè)定不同底物濃度時(shí)的活力。6、用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果，以1/V對(duì)1/[S]作圖，求出Vmax和Km的數(shù)值,五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

67、：1、原始數(shù)據(jù)記錄：不同濃度樣品在不同反應(yīng)時(shí)間的NaOH滴定量(Δm),2、數(shù)據(jù)處理1)用增加的滴定度對(duì)時(shí)間(Δm-Δt)作圖，測(cè)定初速度V02) 用不同濃度的酪蛋白溶液測(cè)定不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)初速度。3) 以1/V對(duì)1/[S]作圖，求出Vmax和Km的數(shù)值,六、思考題：1、如何正確測(cè)定酶促反應(yīng)速度？2、由實(shí)驗(yàn)所得曲線可以看出底物濃度對(duì)酶反應(yīng)的影響有何特殊規(guī)律？七、預(yù)習(xí)： 實(shí)驗(yàn)八 維生素C的定量測(cè)定(P195),實(shí)

68、驗(yàn)八 維生素C的定量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)維生素C定量測(cè)定法的原理和方法2、熟悉、掌握微量滴定法的基本操作技術(shù),二、實(shí)驗(yàn)原理還原型維生素C(抗壞血酸)能還原染料2,6-二氯酚靛酚鈉鹽，本身則被氧化成脫氫維生素C。2,6-二氯酚靛酚鈉鹽的水溶液呈藍(lán)色，在酸性環(huán)境中為玫瑰色，被還原后則脫成無色。(反應(yīng)式見P196圖),本實(shí)驗(yàn)用2,6-二氯酚靛酚在酸性環(huán)境中滴定含有維生素C的樣品溶液。滴定開始時(shí)，樣品液中的維生素C立即將滴入的2