強(qiáng)直性脊柱炎TCR二次重排及BV CDR3譜型和分子特征初步研究.pdf

1、目的：
　　通過分析對(duì)AS患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞TCR BV CDR3譜型多樣性特點(diǎn)及檢測(cè)TCR二次重排的相關(guān)基因，探討TCR CDR3氨基酸序列和TCR二次重排與AS發(fā)病的相關(guān)性，為AS中T細(xì)胞致病機(jī)制的研究和個(gè)性化治療提供一條新的途徑。
　　方法：
　?。?）免疫磁珠法分離AS患者與健康對(duì)照組外周血中的CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞。
　?。?）提取各樣本總RNA并按RT-PCR Kit操作說明書逆轉(zhuǎn)

2、錄合成cDNA。
　　（3）參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)并合成TCR BV亞家族及實(shí)驗(yàn)對(duì)照引物，RT-PCR法擴(kuò)增各樣本TCR亞家族，并用2％瓊脂凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。
　　（4）免疫掃描技術(shù)分析PCR產(chǎn)物，并用將單/寡克隆基因進(jìn)行測(cè)序，分析AS患者CD4+、CD8+TCR BV家族CDR3區(qū)譜系多態(tài)性及克隆性的特點(diǎn)
　　（5）RT-PCR法檢測(cè)各樣本RAG1、RAG2、TdT、Ku70、Ku80表達(dá)情況，同時(shí)檢測(cè)TCR重排過程中間

3、產(chǎn)物BD2-BJ2重排刪除環(huán)。
　　結(jié)果：
　?。?）健康對(duì)照組及AS患者CD4+、CD8+TCR BV各家族PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示，各家族均有表達(dá)。正常健康人CD4+、CD8+TCR BV亞家族免疫掃描均呈正態(tài)分布。
　?。?）12例AS患者CD4+TCR BV家族絕大多數(shù)呈現(xiàn)與健康對(duì)照相似的正態(tài)分布的鐘型峰圖，僅少數(shù)家族呈不規(guī)則異常峰型或偏峰，極少家族出現(xiàn)寡克隆趨勢(shì)，僅2例患者各出現(xiàn)1個(gè)單克隆家族單峰

4、。不同患者的CD4+TCR BV家族異常峰型率在4%（1/26）～27%(7/26)，異常率出現(xiàn)較高的家族有BV2和BV3均為75％(9/12），BV19為50%(6/12)，異常率較低的家族為BV9和BV13.2均為8.3%（1/12）。
　　（3）12例AS患者CD8+TCR BV家族大多數(shù)呈現(xiàn)非正態(tài)異常峰型，其中7例患者CD8+TCR BV家族異常分型率高于50%以上，明顯多于CD4+T細(xì)胞。AS患者CD8+TCR BV26

5、個(gè)亞家族均出現(xiàn)異常峰率，其中異常率較高的家族為BV3和BV19均為83％(10/12），異常率較低的家族為BV8為17%（2/12）。
　　（4）同一患者出現(xiàn)不同BV亞家族單克隆增生，其TCR BV CDR3區(qū)長(zhǎng)度和序列有所不同。同一BV亞家族在不同患者其CDR3區(qū)長(zhǎng)度和序列也不相同。顯示同時(shí)存在一些共同基序。
　　(5）6例AS患者治療前后CD8+TCR BV亞家族異常率均高于治療前后CD4+T細(xì)胞，其中3例患者治療后CD

6、4+TCR BV亞家族異常率下降，4例患者CD8+TCR BV亞家族異常率均下降。
　　(6）20例健康對(duì)照、病例對(duì)照組及AS患者RAG1、RAG2、TdT、Ku70、Ku80 PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示， AS患者、正常健康對(duì)照組均表達(dá)Ku70；8例AS患者、3例正常健康檢測(cè)到Ku80的特異性條帶。其他條帶未檢測(cè)出。
　?。?）16例正常對(duì)照檢出BD1-BJl sjTRECs S1，AS患者均未檢出sjTRECs