肝臟TCRγδ+CD3+CD4-CD8-T細(xì)胞在小鼠病毒性肝炎中的作用及其作用機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的：
　　病毒性肝炎以肝細(xì)胞損傷為主要特征,然而肝細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚未完全明確。目前大部分學(xué)者認(rèn)為肝炎病毒本身并不直接造成肝細(xì)胞的損傷,而機(jī)體抗肝炎病毒的免疫反應(yīng),特別是免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),是造成肝細(xì)胞損傷的主要原因。多種免疫細(xì)胞亞群,如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、NKT細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等,都被證實(shí)在這一病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來隨著對(duì)肝炎發(fā)病機(jī)制研究的深入,越來越多的

2、研究表明非特異性免疫反應(yīng),特別是 NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的非特異性免疫反應(yīng),也參與了病毒性肝炎感染引起肝臟損傷的發(fā)病機(jī)理。我們對(duì) HBV誘導(dǎo)的暴發(fā)型肝衰竭(FHF)和慢加急性肝衰竭(HBV-induced acute-on-chronic liver failure, HBV-ACLF)研究后發(fā)現(xiàn),肝臟 NK細(xì)胞通過死亡受體途徑 Fas/FasL和NK細(xì)胞受體配體識(shí)別途徑 NKG2D/NKG2DL對(duì)肝細(xì)胞造成損傷。在3型鼠肝炎病毒(MH

3、V-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中活化的巨噬細(xì)胞能夠分泌炎性因子 TNF, IL-1進(jìn)一步促進(jìn)肝臟中的炎癥反應(yīng)并加重肝細(xì)胞損傷。此外,活化的巨噬細(xì)胞還分泌促凝血活性物質(zhì) fgl2凝血酶原酶(fibrinogen like protein2), fgl2凝血酶原酶可以激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起肝臟微循環(huán)障礙并導(dǎo)致肝細(xì)胞大塊死亡。因此明確各種免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子形成的免疫網(wǎng)絡(luò)在病毒性肝炎引起肝細(xì)胞損傷中的作用將有助于更加全面的認(rèn)識(shí)病毒性肝炎

4、的發(fā)病機(jī)制,并為其臨床診斷和治療提供重要的靶點(diǎn)。
　　近年研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體存在一種新型 T細(xì)胞亞群——CD3+CD4-CD8-細(xì)胞(雙陰性 T細(xì)胞,DN T)。在健康人群和正常小鼠外周血 T細(xì)胞中,DNT細(xì)胞所占比例為1–5％。隨著對(duì) DN T細(xì)胞的深入研究,越來越多的證據(jù)表明 DNT細(xì)胞在多種疾病,如移植排斥、自身免疫性疾病、腫瘤免疫、感染性疾病、過敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。在不同的疾病中DN T細(xì)

5、胞表達(dá)不同的表面標(biāo)志細(xì)胞,分泌獨(dú)特的效應(yīng)因子,通過這些效應(yīng)因子發(fā)揮其生物學(xué)功能。在器官移植模型中,將脾細(xì)胞來源的DN T細(xì)胞克隆后輸入小鼠體內(nèi),DN T細(xì)胞能夠通過 Fas/Fasl、穿孔素等途徑殺傷抗供者 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞,從而提高移植物的存活時(shí)間和存活率。Zhang, Z等通過對(duì) MRL/lpr小鼠模型中DNT細(xì)胞研究后發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型鼠(MRL/lpr)中DNT細(xì)胞高表達(dá) IL-17和IL-23R,并

6、且與疾病進(jìn)程及嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在感染土拉熱弗郎西絲菌(Francisella tularensis)的小鼠中,研究發(fā)現(xiàn)感染后肺組織中DN T細(xì)胞可以分化為兩個(gè)亞群,一群主要分泌 IL-17,而另一群以分泌 IFN-γ為主,并在疾病進(jìn)程中發(fā)揮不同的生物學(xué)作用。Lis R.V等研究發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲感染者外周血 TCRαβ+DNT(TCRαβ+CD4-CD8-)細(xì)胞可以分泌炎性細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α,而TCRγδ+DNT(TCRγδ+

7、CD4-CD8-)主要分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子 IL-10。
　　迄今,肝臟 DN T細(xì)胞是否在病毒性肝炎中發(fā)揮作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)室以鼠3型肝炎病毒(MHV-3,murine hepatitis virus3)感染 C3H/Hej小鼠成功建立了小鼠病毒性肝炎模型,本研究擬利用MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型,探討 DN T細(xì)胞在病毒性肝炎發(fā)生發(fā)展中的作用。具體研究目標(biāo)如下:
　　1.研究在病毒性肝炎模型小鼠肝臟中DN T細(xì)胞

8、TCRγδ+ DN T細(xì)胞亞群和TCRαβ+DN T細(xì)胞亞群的比例。在疾病進(jìn)程中動(dòng)態(tài)觀察病毒性肝炎模型小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞比例、數(shù)量。
　　2.鑒定肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞的表面標(biāo)志和細(xì)胞因子譜。
　　3.探討肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞細(xì)胞對(duì)肝細(xì)胞的損傷作用及機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.MHV-3腹腔感染途徑建立小鼠病毒性肝炎模型。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常和感染MHV-310天后模型小鼠

9、肝臟 DNT表達(dá) TCRγδ+和TCRαβ+的比例。動(dòng)態(tài)觀察MHV-3感染0、3、7、10、15、20、30天后模型小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞在肝臟 T細(xì)胞中比例變化及其絕對(duì)計(jì)數(shù)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)志 CD30、 CD25、CD28和CD44的百分率、感染 MHV-3后各時(shí)間點(diǎn)肝臟TCRγδ+DN T細(xì)胞表達(dá)活化標(biāo)志 CD69分子的百分

10、率。采用細(xì)胞因子染色法檢測(cè)肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞分泌 IL-2、 IL-4、 IL-10、IL-17A、IL-21、IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,tumor necrosis factor-α)、γ-干擾素(interferon,IFN-γ)、穿孔素(perforin)和顆粒酶 B(granzyme B)的水平。采用α-GalCer:mCD1d二聚體來鑒定肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞與 NKT細(xì)胞之間的關(guān)系。

11、>　　3.體外實(shí)驗(yàn):磁珠分選肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞。膠原酶原位灌流消化法分離小鼠原代肝細(xì)胞。以感染 MHV-310天的C3H/Hej小鼠肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞,肝細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用非放射性細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞在體外對(duì)正常或感染 MHV-3的原代肝細(xì)胞的殺傷活性。采用Transwell法檢測(cè)肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞對(duì)肝臟細(xì)胞的殺傷作用是否依賴細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸。在體外,通過抗體阻斷

12、TNF-α, IFN-γ和IL-17A檢測(cè)肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞殺傷肝細(xì)胞的作用途徑。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將磁珠分選純化的肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞經(jīng)尾靜脈被動(dòng)轉(zhuǎn)移過繼到MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠體內(nèi)(3×106/只),同體積 PBS液尾靜脈轉(zhuǎn)移過繼到 MHV-3感染5天后 C3H/Hej小鼠體內(nèi)作為對(duì)照,觀察兩組生存曲線、轉(zhuǎn)移過繼3天后各組外周血 AST和ALT水平、肝臟組織 H-E染色。
　

13、　結(jié)果：
　　1.在正常小鼠和MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型中,肝臟DN T細(xì)胞以TCRγδ+ DN T細(xì)胞亞群為主。在感染 MHV-3后各時(shí)間點(diǎn)肝臟 TCRγδ+DN T在肝臟 T淋巴細(xì)胞中的比例較感染前顯著升高,在感染后10天達(dá)到最高值(19.7±3.22％);肝臟TCRγδ+DN T細(xì)胞數(shù)量在 MHV-3感染后顯著增加,在感染后10天達(dá)到最高峰(6.51±1.29×105)。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) MHV-3誘導(dǎo)

14、的小鼠病毒性肝炎模型中肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞的表面標(biāo)志為 TCRγδ+ CD3+ CD4- CD8- CD25- CD28- CD30- CD44+。肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞不能特異性識(shí)別α-半乳糖酰基鞘氨醇,表明這群細(xì)胞不屬于 NKT細(xì)胞亞群。在感染 MHV-3后,隨著病程進(jìn)展,肝臟 TCRγδ+DNT表面活化標(biāo)志 CD69分子表達(dá)水平持續(xù)升高,在感染后10天達(dá)到最高水平(83.45±5.32％)。模型中肝臟TCRγδ+D

15、N T表達(dá) TNF-α、INF-γ、IL-17A和IL-2,幾乎不表達(dá) IL-4、IL-10、IL-21、IL-22、FasL、穿孔素(perforin)和顆粒酶 B(granzyme B)。
　　3.體外實(shí)驗(yàn):MHV-3誘導(dǎo)的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞對(duì)染后肝細(xì)胞有明顯的殺傷作用。通過 Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞對(duì)感染后肝細(xì)胞的直接殺傷作用不需要細(xì)胞與細(xì)胞間的接觸

16、。通過抗體阻斷試驗(yàn)證明,阻斷 TNF-a后肝臟 TCRγδ+DN T細(xì)胞對(duì)感染后肝細(xì)胞的殺傷作用顯著降低,而單獨(dú)阻斷 IFN-γ或 IL-17A后肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞對(duì)感染后肝細(xì)胞的殺傷作用無顯著改變。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn):將感染 MHV-310天后小鼠病毒性肝炎模型中肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞過繼給感染 MHV-35天后小鼠病毒性肝炎模型小鼠,小鼠生存率顯著降低,從41.7％下降至8.33％。在過繼3天后,肝臟 TCRγ

17、δ+ DN T細(xì)胞轉(zhuǎn)移過繼組小鼠血清 ALT和AST水平較 PBS過繼對(duì)照組顯著升高;在過繼3天后,肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞轉(zhuǎn)移過繼組肝臟病理?yè)p傷較 PBS過繼對(duì)照組更加明顯,出現(xiàn)肝細(xì)胞水腫、氣球樣變、點(diǎn)狀壞死、灶狀壞死,甚至碎片狀壞死,并伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究首次利用MHV-3誘導(dǎo)的小鼠病毒性肝炎模型探討了肝臟 TCRγδ+ DN T細(xì)胞在病毒性肝炎中的作用。研究發(fā)現(xiàn)小鼠病毒性肝炎模型中

18、肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞具有獨(dú)特的表面標(biāo)志。這群細(xì)胞不屬于 NKT細(xì)胞亞群。在感染 MHV-3后,肝臟TCRγδ+DNT細(xì)胞的數(shù)量大量增加并且大量活化,表達(dá)細(xì)胞因子 TNF-α、IFN-γ、IL-17A和IL-2。
　　2.MHV-3誘導(dǎo)的病毒性肝炎小鼠模型中,感染后肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞對(duì)感染后肝細(xì)胞有顯著的殺傷作用。這種殺傷作用不依賴細(xì)胞和細(xì)胞間的接觸。通過抗體阻斷實(shí)驗(yàn)證明肝臟 TCRγδ+DNT細(xì)胞主要是通過 TN