TCRαβ+CD4-CD8-T細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的致病作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以大量自身抗體形成為特征的慢性自身免疫性疾病，該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜，累及全身各大系統(tǒng)，病程遷延，嚴(yán)重危害人類健康。SLE的病因較為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明了，細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)異常是發(fā)病機(jī)制中的主要環(huán)節(jié)，尤其是淋巴細(xì)胞的活化以及一系列炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生均可導(dǎo)致補(bǔ)體激活、免疫復(fù)合物的沉積和靶器官的細(xì)胞浸潤，在SLE的發(fā)病中起著重要作

2、用。
　　 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體維持自身免疫耐受和調(diào)節(jié)各種免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞，在SLE以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)等自身免疫性疾病的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有多種表型，其中，TCRαβ+CD4-CD8-即雙陰性T細(xì)胞(Double negative T cells，DNT細(xì)胞)是一類新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，正常情況下，DNT細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中的比例僅占1％左右。國外有研究顯示

3、DNT細(xì)胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中顯著增加，并且增加的DNT細(xì)胞具有炎癥細(xì)胞的表型，在疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。臺灣學(xué)者發(fā)現(xiàn)在中國的SLE患者外周血中DNT細(xì)胞也有升高的趨勢，但與正常對照者相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們前期通過小樣本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血中DNT細(xì)胞顯著增加，并與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，在本研究中我們將通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來加以證實(shí)，并尋找SLE患者DNT細(xì)胞與疾病發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān)性。
　　 SLE患者

4、中DNT細(xì)胞增加的機(jī)制目前尚不清楚。Fas途徑是體內(nèi)維持T細(xì)胞平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，在維持DNT細(xì)胞在組織中的正確分布起著重要的作用。細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)率降低會導(dǎo)致該細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性降低，從而逃逸Fas-FasL途徑介導(dǎo)的凋亡。SLE患者中升高的DNT細(xì)胞是否是由于其表面Fas受體的表達(dá)率降低所致，以及DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)是否與疾病活動性有關(guān)，目前尚未見相關(guān)報道。
　　 有關(guān)DNT細(xì)胞功能，目前研究較多的

5、是DNT細(xì)胞的免疫抑制作用。然而，研究者發(fā)現(xiàn)在SLE患者中增加的DNT細(xì)胞可通過與B淋巴細(xì)胞的相互作用促進(jìn)自身抗體的產(chǎn)生，在狼瘡腎炎的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。此外，在狼瘡小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)DNT細(xì)胞顯著增加，分泌大量的IL-17，并且與疾病的嚴(yán)重性呈顯著地正相關(guān)關(guān)系。白細(xì)胞介素-17(Interleukine-17，IL-17)是由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子。研究證實(shí)IL-17在慢性炎癥時可導(dǎo)致組織損傷，在SLE的炎癥反應(yīng)中扮演著重

6、要角色。目前為止，國外僅有一篇文獻(xiàn)報道SLE患者外周血中的DNT細(xì)胞可以分泌細(xì)胞因子IL-17，并在腎組織的活檢標(biāo)本中證實(shí)有DNT細(xì)胞與IL-17的沉積，并認(rèn)為DNT細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17在狼瘡腎炎的發(fā)病中起重要作用，國內(nèi)尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。
　　 研究目的:
　　 目前，雖然對SLE的研究眾多，但是SLE的發(fā)病機(jī)制仍然沒有闡明，SLE中DNT細(xì)胞增加的原因仍不清楚，有關(guān)SLE患者中DNT細(xì)胞功能方面的研究甚少，

7、因此深入了解DNT細(xì)胞在SLE中的作用及作用機(jī)制對SLE發(fā)病機(jī)理的研究具有重要意義。本課題結(jié)合國內(nèi)外研究進(jìn)展和我們前期的工作，分別以SLE患者、RA患者以及正常對照者為研究對象，觀察各研究對象中DNT細(xì)胞數(shù)量的變化及其表面Fas受體表達(dá)的情況，探討DNT細(xì)胞與Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性的關(guān)系，從而探討SLE患者中DNT細(xì)胞增加的原因及其與疾病的相關(guān)性;通過檢測SLE患者和正常對照者外周血各T細(xì)胞亞群在不同條件刺激下細(xì)胞因子IL-17的分泌情

8、況，證實(shí)DNT細(xì)胞在SLE患者炎癥反應(yīng)中的作用及作用機(jī)制，為SLE的發(fā)病機(jī)制的研究提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，從而為SLE的診斷和治療開辟新的思路。
　　 研究方法:
　　 1、研究對象
　　 病例組:隨機(jī)選擇2011年5月至2012年1月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院確診為SLE的56例患者作為病例組，其中男性3例，女性53例，平均年齡為28.07±10.84歲。所有納入的患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1997年推薦

9、的SLE的分類標(biāo)準(zhǔn)，并除外感染、原發(fā)性心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及合并其他自身免疫病史等。采用系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)評分(Systemic lupus erythematosusdisease activity index，SLEDAI)對患者進(jìn)行疾病活動性評估，根據(jù)0～4分為基本無活動，5～9分為輕度活動，10～14分為中度活動，≧15分為重度活動，結(jié)合我們的研究目的，將評分＜10分定義為緩解期，≧10分定義為活動期。
　　

10、 1.1、疾病對照組:根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1987年修訂的RA的分類標(biāo)準(zhǔn)，選取同期南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院確診為RA的25例患者作為疾病對照組，其中男性2例，女性23例，平均年齡為32.56±4.22歲。除外感染、原發(fā)性心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及合并其他自身免疫病史等。
　　 1.2、正常對照組:隨機(jī)選取同期南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院27例健康查體者作為正常對照組，平均年齡32.37±10.02歲，其中男性2例，女性25例，均排除

11、感染、原發(fā)性的心、肝、腎等器質(zhì)性病變以及自身免疫病史等。三組年齡、性別之間均無顯著性差異。
　　 2、研究方法
　　 2.1、采用多色流式細(xì)胞術(shù)分別檢測56例SLE患者、25例RA患者以及27例正常對照者外周血DNT細(xì)胞的比例以及其表面Fas受體的表達(dá)情況
　　 將用于標(biāo)記的熒光抗體和相應(yīng)的同型對照分別置于流式管底部，分別加入適量全血，輕輕混勻，避光孵育、溶血、洗滌細(xì)胞后，PBS重懸細(xì)胞，采用BDFACS-Cal

12、ibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計數(shù)至少10萬個細(xì)胞，以FSC/SSC二維散射光設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞群，利用BD公司Cell Quest軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析，檢測外周血中DNT細(xì)胞以及表面Fas受體的表達(dá)情況。
　　 2.2、采用多色流式細(xì)胞術(shù)分別檢測13例SLE患者以及7例正常對照者全血中各T淋巴細(xì)胞亞群胞內(nèi)的細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)情況
　　 取適量肝素鈉抗凝全血，加入RPMI1640全培，混勻后加入佛波酯(Phorb

13、olmyristate acetate，PMA)、鈣離子導(dǎo)入劑(Ionomycin)聯(lián)合刺激以及布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA)進(jìn)行阻斷，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5個小時后收集細(xì)胞，離心后去上清，混勻，進(jìn)行表面染色、固定、破膜和胞內(nèi)染色。采用BD FACS-Calibur流式細(xì)胞儀檢測全血中各淋巴細(xì)胞亞群的比例以及其胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)。
　　 2.3、采用多色流式細(xì)胞術(shù)分別檢測13例SLE患者以

14、及7例正常對照者分離的外周血單個核細(xì)胞在有或無anti-CD3刺激培養(yǎng)5天后各T淋巴細(xì)胞亞群胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)情況
　　 采用梯度密度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種到預(yù)先包被好anti-CD3的12孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。在收集細(xì)胞前的5個小時加入PMA、Ionomycin以及BFA阻斷劑培養(yǎng)刺激，收集細(xì)胞，離心去上清，混勻后進(jìn)行表面染色、固定、破膜和胞內(nèi)染色。采用BDFAC

15、S-Calibur流式細(xì)胞儀分別檢測在有或無anti-CD3刺激培養(yǎng)5天后外周血單個核細(xì)胞中各T淋巴細(xì)胞亞群比例以及胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)情況。
　　 3、統(tǒng)計方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。所有計量資料均采用(x)±s表示，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)不滿足正態(tài)性和（或）方差齊性，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，兩配對樣本比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性采用spearman相關(guān)

16、以及偏相關(guān)進(jìn)行分析，多個獨(dú)立樣本比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，其中兩兩比較用Bonferroni法。取α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，Bonferroni法以調(diào)整后的α'=0.05/3=0.017為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1、SLE患者外周血中DNT細(xì)胞的比例及其與疾病活動性的相關(guān)性
　　 1.1、外周血DNT細(xì)胞占TCRαβ+細(xì)胞比例的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較有顯著性差異(P＜0.0

17、01)。其中，SLE組DNT細(xì)胞的比例顯著高于正常對照組(2.45±1.45 vs.1.08±0.62，P＜0.001);與RA組比較，SLE組DNT細(xì)胞的比例顯著增高(2.45±1.45 vs.1.57±0.98，P=0.002)，RA組與NC組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 1.2、SLE患者外周血中的DNT細(xì)胞與疾病活動的相關(guān)性分析顯示，初發(fā)患者的DNT細(xì)胞高于復(fù)查患者;活動期SLE患者外周血DNT細(xì)胞顯著高于緩解期患

18、者;SLE患者中補(bǔ)體降低組的DNT細(xì)胞比例顯著高于補(bǔ)體正常組。SLE患者外周血DNT細(xì)胞與自身抗體的水平之間無顯著相關(guān)性，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)(SLEDAI)之間呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.376，P=0.005)。
　　 2、SLE患者外周血DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)與疾病活動性的相關(guān)性
　　 2.1、外周血DNT細(xì)胞表面Fas受體表達(dá)的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較具有顯著性差異(P=0.015)，其中

19、，SLE組與正常對照組相比，SLE組外周血DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)顯著增加(1.44±0.91 vs.0.91±0.55，P=0.004)，SLE組與RA組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;RA組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.2、外周血DNT細(xì)胞表面Fas受體表達(dá)率的比較中，SLE、RA、NC三組總體比較具有顯著性差異(P＜0.001)。其中，SLE組與正常對照組相比，SLE組DNT細(xì)胞表面Fas表達(dá)率顯著降低(6

20、1.39±19.20vs.75.95±8.88，P＜0.001);SLE組與RA組相比，SLE組DNT細(xì)胞表面的Fas表達(dá)率也顯著降低(61.39±19.20 vs.74.11±12.82，P=0.004)。RA組與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.3、SLE患者DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)與患者疾病活動性的關(guān)系分析中，SLE患者DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)與DNT細(xì)胞的比例呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.796，P＜

21、0.001);SLE患者中補(bǔ)體降低組的DNT細(xì)胞表面Fas受體表達(dá)顯著高于補(bǔ)體正常組;SLE患者DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)與疾病活動指數(shù)(SLEDAI)之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.332，P=0.014）。SLE患者DNT細(xì)胞表面Fas受體表達(dá)率與抗雙鏈DNA抗體以及抗核抗體水平之間均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與SLEDAI相關(guān)性不顯著。
　　 3、不同刺激下，各T細(xì)胞亞群的比例及其分泌IL-17比例及SLE患者中DNT細(xì)胞分泌

22、的IL-17與疾病活動性的相關(guān)性
　　 3.1、經(jīng)過5小時培養(yǎng)刺激后，SLE患者全血中的總T細(xì)胞（TCRαβ+細(xì)胞）比例與正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，TCRαβ+細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（1.22±0.74 vs.0.42±0.29，P=0.030）;CD4+CD8-細(xì)胞比例顯著低于對照組(37.22±7.02 vs.45.80±6.99，P=0.019)。CD4+CD8-細(xì)胞分泌的IL-17與正常對照組之間

23、的差異無統(tǒng)計學(xué)意義;CD8+CD4-細(xì)胞比例及其分泌的IL-17與正常對照組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;DNT細(xì)胞的比例顯著高于正常對照組(4.76±1.15 vs.1.80±0.62，P＜0.001)，DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（0.42±0.31 vs.0.03±0.02，P＜0.001）。
　　 3.2、經(jīng)過5天無anti-CD3刺激培養(yǎng)后，SLE患者的TCRαβ+細(xì)胞、CD4+CD8-細(xì)胞以及CD8+CD4

24、-細(xì)胞比例與正常對照組之間均差異無統(tǒng)計學(xué)意義;DNT細(xì)胞比例顯著高于正常對照組（7.83±1.71 vs.1.97±0.88，P＜0.001）。SLE患者外周血單個核細(xì)胞中的以上四種細(xì)胞分泌的IL-17均顯著高于正常對照組(P均＜0.05)。
　　 3.3、經(jīng)過5天有anti-CD3刺激培養(yǎng)后，SLE患者的TCRαβ+細(xì)胞以及CD8+CD4-細(xì)胞與正常對照組相似，CD4+CD8-細(xì)胞比例低于正常對照組（44.11±9.21 vs

25、.57.14±9.97，P=0.014）;DNT細(xì)胞比例顯著高于對照組（16.94±4.43 vs.5.74±2.35，P＜0.001）。SLE患者TCRαβ+細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（0.73±0.22 vs.0.42±0.18，P=0.008）;CD4+CD8-細(xì)胞以及CD8+CD4-細(xì)胞分泌的IL-17與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組（1.50±0.90 vs.0.64

26、±0.50，P=0.024）。
　　 3.4、SLE患者在有或無anti-CD3刺激的比較中，有anti-CD3刺激組的CD4+CD8-細(xì)胞比例低于無刺激組（44.11±9.21 vs.48.50±13.03，P=0.028），有anti-CD3刺激組的DNT細(xì)胞比例顯著高于無刺激組（16.94±4.4 vs.37.83±1.71，P=0.001）。有刺激組的CD4+CD8-細(xì)胞分泌的IL-17低于無刺激組（0.46±0.17v

27、s.0.68±0.31，P=0.028），有anti-CD3刺激的DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于無刺激組（1.50±0.90 vs.0.67±0.40，P=0.002）。
　　 3.5、在anti-CD3刺激培養(yǎng)5天的條件下，SLE患者DNT細(xì)胞分泌的IL-17與疾病活動性的相關(guān)性分析中，補(bǔ)體降低組的DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于補(bǔ)體正常組，活動期患者的DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于緩解期患者。SLE患者DNT細(xì)胞分

28、泌的IL-17與抗雙鏈DNA抗體以及抗核抗體的水平之間無顯著相關(guān)性，與SLEDAI之間呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.573，P=0.041)。
　　 結(jié)論:
　　 1、SLE患者外周血DNT細(xì)胞比例顯著高于RA患者以及正常對照者，活動期SLE患者的DNT細(xì)胞顯著高于緩解期患者，且DNT細(xì)胞的比例與疾病活動指數(shù)之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，表明DNT細(xì)胞的升高與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，DNT細(xì)胞可能參與了SLE的發(fā)病。
　　

29、2、SLE患者外周血DNT細(xì)胞表面的Fas表達(dá)率顯著低于RA患者以及正常對照者，表明DNT細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的凋亡敏感性降低，可能是DNT細(xì)胞增加的原因之一。DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)顯著高于正常對照者，并與疾病活動密切相關(guān)，表明DNT細(xì)胞表面Fas受體的表達(dá)在一定程度上可以反映SLE患者疾病的活動性。
　　 3、SLE患者DNT細(xì)胞分泌的IL-17顯著高于正常對照組，在anti-CD3刺激后，DNT細(xì)胞能迅速增殖，產(chǎn)生大量I