Id3在慢性病毒感染中對CD8+T細胞表型及功能的調(diào)控.pdf

1、慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV感染等嚴重威脅著人類健康，其中尤以HIV病毒感染是目前醫(yī)學研究領域的難題和熱點。目前臨床針對HIV主要采取HAART療法，但是HAART治療無法完全清除人體內(nèi)所有潛伏的HIV病毒。HIV病毒在感染后早期即可侵入淋巴濾泡內(nèi)的TFH細胞并潛伏起來從而逃過HAART藥物治療和免疫細胞的殺傷，這些被感染的TFH細胞成為徹底治愈HIV患者的最大障礙。因此除外源性藥物治療外，有必要更加深入的了解慢性病毒感染情況

2、下的免疫影響機制，為增強機體免疫系統(tǒng)清除病毒和免疫監(jiān)視能力從而進一步控制感染提供新的治療策略。
　　在免疫系統(tǒng)中，CD8+T細胞通過殺傷被病毒感染的靶細胞而成為控制病毒感染的主要細胞亞群。在急性病毒感染過程中，CD8+T細胞被激活后開始大量增殖，并且在短期內(nèi)迅速清除體內(nèi)的病毒。隨之在失去抗原刺激后大部分CD8+T細胞走向凋亡，但是其中仍有少量細胞繼續(xù)生存下來并分化為病毒特異性的記憶性CD8+T細胞。這些記憶性CD8+T細胞能夠?qū)ο?/p>

3、同抗原再次快速產(chǎn)生效應，同時具有很強的增殖潛力并且可以在沒有抗原的情況下長期維持穩(wěn)態(tài)增殖，從而為機體提供長久的保護。相反，在慢性病毒感染中，CD8+T細胞無法完全清除病毒，并長期接受病毒抗原的刺激以及其它抑制性信號的調(diào)節(jié)，從而隨著病毒感染的進程而逐漸喪失自身的功能，最終走向耗竭(exhaustion)。
　　慢性病毒感染中的CD8+T細胞表面開始逐漸表達多種抑制性受體并且隨著耗竭程度的加深其表達的數(shù)量和種類也逐漸提高。同時，耗竭的

4、CD8+T細胞逐步喪失自身的多種抗病毒功能，而最后嚴重耗竭的病毒特異性CD8+T細胞自身開始凋亡，數(shù)量逐漸減少。在慢性病毒感染過程中，更高的病毒載量、更持久的感染過程或者更少來自CD4+T細胞的幫助都會造成更嚴重的CD8+T細胞耗竭。而在人類的慢性病毒感染，如HIV，HBV，HCV和HTLV等感染中，同樣發(fā)現(xiàn)了CD8+T細胞的耗竭和凋亡。
　　然而在慢性病毒感染過程中，耗竭的CD8+T細胞仍然具有部分效應功能，并且在一定程度上控制

5、病毒的復制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在LCMV-Cl13小鼠感染模型的耗竭CD8+T細胞中存在一群CXCR5陽性的CD8+T細胞。這群細胞相較于其它CXCR5陰性的CD8+T細胞，其表面表達更少的起負調(diào)控作用的抑制性分子如PD-1、Tim3、2B4、Lag3等。在接受體外刺激后，CXCR5+ CD8+T細胞能夠分泌更多的細胞因子和脫顆粒標志物CD107，而且有更多比例的細胞能同時分泌多種細胞因子。同時，這群細胞也表現(xiàn)出更強的細胞殺傷和控制病毒復

6、制的能力，較高地表達與記憶細胞相關(guān)的表面分子CD127和CD62L，具有更強的增殖能力和類似造血干細胞一樣的能力。因此，這群CXCR5+ CD8+T細胞可能在耗竭的T細胞中起主要的抗病毒的作用。而最近在包括LCMV、SIV、HIV等慢性病毒感染的多項研究中發(fā)現(xiàn)高表達CXCR5的病毒特異性的CD8+T細胞遷移進入淋巴組織B細胞濾泡的現(xiàn)象。并且這群CXCR5+ CD8+T細胞能夠殺傷濾泡中被感染的TFH細胞，控制TFH細胞內(nèi)的病毒復制，這一

7、群細胞的發(fā)現(xiàn)為削減HIV病毒以及功能性治愈HIV感染提供了新的重要線索。
　　在急性和慢性病毒感染中，CD8+T細胞的分化或功能受到一系列分子通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中DNA結(jié)合抑制蛋白(ID蛋白)是急性病毒感染中調(diào)控CD8+T細胞分化的重要分子。在急性病毒感染中，Id3能夠促進記憶性CD8+T細胞形成并通過增強調(diào)節(jié)DNA復制和修復相關(guān)的基因表達來維持其存活。此外Id2也參與調(diào)節(jié)CD8+T細胞的分化，并且與Id3的作用截然相反。而

8、且Id2可能通過E2A來抑制性調(diào)節(jié)Id3的表達。而在LCMV慢性病毒感染中，E2A能夠直接與Cxcr5基因的調(diào)控區(qū)結(jié)合并促進CD8+T細胞表面CXCR5的表達，Id2則可以抑制E2A與該基因的結(jié)合。敲除Id2或者過表達E2A均能夠促進CXCR5陽性CD8+T細胞的生成，并增強CXCR5+ CD8+T細胞分泌細胞因子的能力和細胞殺傷能力。在LCMV-Docile慢性感染模型中，Id3+2B4-的病毒特異性CD8+T細胞也能夠分化為Id3-

9、2B4-或者Id3-2B4+的病毒特異性CD8+T細胞，而不能反向分化。而過表達Id3則能夠抑制CD8+T細胞表面Fas的表達，減少來自Fas/FasL介導的細胞凋亡來維持CD8+T細胞的存活。因此急性病毒感染后Id3高表達的CD8+T細胞和慢性病毒感染中CXCR5+ CD8+T細胞在表型、功能和分化等多個方面均表現(xiàn)出高度的一致性。但是慢性病毒感染情況下CD8+T細胞內(nèi)Id3與CXCR5表達之間的關(guān)系以及Id3對CXCR5+CD8+T細

10、胞表型和功能的影響仍不清楚。
　　因此，我們對Id3在慢性病毒感染中對CXCR5陽性CD8+T細胞的表型和功能的調(diào)控作用進一步研究，本研究中的實驗方法、實驗結(jié)果和結(jié)論條列如下:
　　1.我們在普通B6小鼠感染LCMV-Cl13病毒后的第8，24和32天，取小鼠的脾細胞，經(jīng)CD8+T細胞富集后通過抗體染色和流式細胞分選分別獲得CXCR5+ CD8+T細胞和CXCR5-CD8+T細胞，抽取二者的總RNA并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再

11、通過RT-qPCR測量兩群細胞中Id2和Id3的mRNA表達量。結(jié)果顯示相較于CD44hi CXCR5-CD8+T細胞，CD44hi CXCR5+ CD8+T細胞中的Id3表達量在LCMV慢性感染后的三個時間點均較高，而Id2表達量較低。并且Id2和Id3在這兩群細胞中的表達量在這段時間內(nèi)保持穩(wěn)定。
　　2.給予CD4Cre Id2flox/flox小鼠LCMV-Cl13病毒感染，并在耗竭期取脾臟細胞計數(shù)并行流式染色分析CD44h

12、i CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細胞的數(shù)量、表面抑制性分子的表達和分泌細胞因子的功能。結(jié)果表明，Id2-/-小鼠脾臟中CD44hi CXCR5+ CD8+T細胞占已被激活的CD8+T細胞的比例和數(shù)量均升高，而表面抑制性分子的表達量下降。經(jīng)體外病毒肽刺激后，Id2條件敲除小鼠體內(nèi)能夠分泌細胞因子TNFα或表達脫顆粒標志物CD107a/b的CD8+T細胞數(shù)更多。同時Id2敲除小鼠較普通小鼠脾臟和肺臟中病毒滴度顯著降低。

13、
　　3.給予CD4Cre Id3flox撇小鼠LCMV-Cl13病毒感染，在耗竭期取脾臟細胞計數(shù)并行流式染色分析CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細胞的數(shù)量和功能。結(jié)果表明，兩組小鼠中CD44hi CXCR5+ CD8+T細胞表面抑制性分子的表達量均較CXCR5-CD8+T細胞群為低。但是Id3條件敲除小鼠脾臟中CD44hi CXCR5+ CD8+T細胞占已被激活的CD8+T細胞的比例沒有出現(xiàn)改變，

14、而CD44hi CXCR5+和CD44hi CXCR5-CD8+T細胞的數(shù)量均增加，兩群細胞表面抑制性分子的表達量均下降。經(jīng)體外病毒肽刺激后，Id3條件敲除小鼠體內(nèi)CD8+T細胞能夠分泌更多的細胞因子TNFα并表達更多的脫顆粒標志物CD107a/b。同時通過RT-qPCR方法測量兩組小鼠的組織內(nèi)所含病毒滴度顯示Id3敲除小鼠較普通小鼠脾臟和肺臟中病毒滴度顯著降低近10倍。
　　4.我們構(gòu)建了Id3過表達質(zhì)粒，并最終將其轉(zhuǎn)導進入P1

15、4細胞。然后將這些細胞注入受體小鼠體內(nèi)并給予LCMV-Cl13感染。在感染后第8天我們測量了過表達Id3的P14細胞中CXCR5的表達以及分泌細胞因子的能力。結(jié)果顯示，過表達Id3和對照組的P14細胞中CXCR5的表達量無顯著差異，而Id3過表達也未顯著改變整體CD8+T細胞的功能。
　　5.通過HIV患者淋巴結(jié)免疫熒光染色我們發(fā)現(xiàn)CD8+T細胞遷移進入B細胞淋巴濾泡。淋巴結(jié)細胞流式染色發(fā)現(xiàn)，CXCR5+CD8+T細胞表達較高的I