補(bǔ)體C3在李斯特菌感染模型中調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成.pdf

1、在胞內(nèi)菌和病毒感染后，特異性CD8+T細(xì)胞在接收抗原呈遞細(xì)胞(APCs)傳遞的抗原信號，共刺激信號和細(xì)胞因子信號后發(fā)生分裂增殖分化為效應(yīng)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量迅速擴(kuò)增在感染后7-8天左右達(dá)到高峰。隨后大部分效應(yīng)CD8+T細(xì)胞發(fā)生凋亡，約10％左右存活下來并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L期存活的記憶細(xì)胞。根據(jù)特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答動(dòng)力曲線，可以將整個(gè)應(yīng)答過程劃分為效應(yīng)期、收縮期和記憶期。效應(yīng)期CD8+T增殖的同時(shí)伴隨細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞并趨化至感染部位清除病原。收

2、縮期和記憶期的意義在于機(jī)體可以避免應(yīng)答過度導(dǎo)致病理性損傷，也可以保持靈活性以應(yīng)對新的病原感染。記憶細(xì)胞則可以在相同病原再次感染時(shí)發(fā)揮更強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答，所以針對收縮期和記憶期的調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的生理意義。補(bǔ)體是參與抵御病原感染的天然免疫的一個(gè)重要的組成部分，近年很多文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)體具有更廣泛的生理作用，其中包括調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫。補(bǔ)體除了在多個(gè)階段多種層次上調(diào)節(jié)B細(xì)胞免疫外，還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等。目前有研究發(fā)現(xiàn)在移植和病毒感染

3、模型中補(bǔ)體可調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞初次應(yīng)答，但是對于補(bǔ)體是否可以調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成還不是很清楚。
　　我們利用胞內(nèi)菌減毒的李斯特菌(△rLm-OVA)系統(tǒng)性感染C3缺陷（C3-/-）小鼠，并胞內(nèi)IFN-γ流式染色方法和Kb/OVA pentamer方法檢測其特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答動(dòng)力學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)盡管C3-/-小鼠中CD8+T細(xì)胞初次應(yīng)答比WT對照小鼠要低，但其CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮相對減少并伴隨記憶形成增多。

4、用烈性李斯特菌(rLm-OVA)感染C3-/-小鼠和WT對照，同樣發(fā)現(xiàn)了在C3-/-小鼠中特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮相對減少和記憶形成增多。
　　眼鏡蛇毒因子(Cobra Venom Factor, CVF)處理小鼠可以消耗其循環(huán)或系統(tǒng)性補(bǔ)體C3。我們用CVF處理(-1-14天)小鼠后發(fā)現(xiàn)處理組小鼠循環(huán)補(bǔ)體C3水平降至正常水平的十分之一左右。結(jié)果顯示相對于對照小鼠，CVF處理小鼠內(nèi)的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮減少和記憶形成增多

5、。因此，我們推測循環(huán)補(bǔ)體在李斯特菌感染模型中發(fā)揮主要的調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的作用。
　　之前很多文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)主要是在APC-T細(xì)胞局部產(chǎn)生的補(bǔ)體發(fā)揮調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫的作用。為了進(jìn)一步明確是肝臟來源的系統(tǒng)性補(bǔ)體C3發(fā)揮主要作用或是單核-淋巴細(xì)胞來源的局部補(bǔ)體C3發(fā)揮主要的作用，我們采用骨髓嵌合小鼠來進(jìn)行研究。骨髓嵌合小鼠中系統(tǒng)性補(bǔ)體C3來自受體小鼠，單核-淋巴細(xì)胞來源的局部補(bǔ)體C3來源于供體小鼠，可以用以區(qū)別系統(tǒng)性補(bǔ)體和局部補(bǔ)體的對特異

6、性CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。亞致死劑量的γ射線輻照WT和C3-/-小鼠受體小鼠后分別過繼轉(zhuǎn)移WT或C3-/-來源的骨髓細(xì)胞，總共形成四組。等骨髓重建2個(gè)多月后，對四組小鼠進(jìn)行李斯特菌感染，并觀察其CD8+T細(xì)胞應(yīng)答動(dòng)力學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無論接受什么背景的骨髓細(xì)胞，C3-/-受體小鼠組的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮相比WT受體小鼠組減少。而同一背景小鼠分別接受了來自WT和C3-/-來源的骨髓細(xì)胞的后，兩組CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收

7、縮程度無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。由此我們認(rèn)為肝臟來源的系統(tǒng)性C3在調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成中發(fā)揮主要作用。
　　CVF干預(yù)系統(tǒng)性C3可以調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成。這提示了其在設(shè)計(jì)改善疫苗效果方面應(yīng)用的可能性。我們想知道在C3缺陷(C3-/-)或CVF處理小鼠的條件下形成的記憶性CD8+T細(xì)胞功能情況。記憶性CD8+T細(xì)胞有著與初始CD8+T細(xì)胞和效應(yīng)CD8+T細(xì)胞不一樣的表型和功能。首先，我們先檢測C3-/-與WT

8、小鼠中形成的記憶性CD8+T細(xì)胞表型表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD62L、KLRG-1、CD127、CD44，以及IL-2分泌能力都沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其次，我們過繼轉(zhuǎn)移用不同濃度CFSE標(biāo)記的負(fù)載和不負(fù)載OVA肽的靶細(xì)胞至記憶期的C3-/-和WT小鼠，檢測其特異性CD8+T細(xì)胞的體內(nèi)殺傷能力。結(jié)果顯示C3-/-小鼠內(nèi)的靶細(xì)胞殺傷比例大于WT小鼠，與其特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)差別一致，因此我們推測細(xì)胞平均殺傷能力在C3-/-和WT小鼠中并無明顯差

9、別。再次，CVF處理小鼠和對照小鼠在記憶期給予再次感染后，兩組小鼠中記憶性CD8+T細(xì)胞擴(kuò)增速度一致，表現(xiàn)出相似的應(yīng)答強(qiáng)度，表明C3被消耗情況下形成的CD8+T細(xì)胞再次應(yīng)答能力與WT小鼠無差異。最后，同時(shí)分別將C3-/-和WT小鼠內(nèi)的記憶性CD8+T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移至未感染的野生小鼠中，感染后檢測兩組受體小鼠中過繼轉(zhuǎn)移的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答能力強(qiáng)弱差異。結(jié)果顯示來自C3-/-和WT的過繼轉(zhuǎn)移的記憶性CD8+T細(xì)胞增殖后擴(kuò)增倍數(shù)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

10、。這些結(jié)果表明C3缺陷或被消耗的情況下生成的記憶性CD8+T細(xì)胞具有正常的表型和功能。
　　可以在CD8+T細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng)期和收縮期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的因素不同。我們用CVF分別在效應(yīng)期(-1-6天)或收縮期(7-14天)處理小鼠，試圖確定補(bǔ)體在哪個(gè)時(shí)期調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成。我們發(fā)現(xiàn)在效應(yīng)期給予CVF處理小鼠的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮比對照減少，而收縮期CVF給予處理小鼠的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮與對照無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這一

11、結(jié)果表明C3主要在效應(yīng)期對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。接下來我們致力于分析已知在效應(yīng)期可以塑造CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的因素是否參與C3對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成的調(diào)節(jié)過程。
　　首先，有文獻(xiàn)報(bào)道在效應(yīng)期后期持續(xù)存在的抗原可能影響CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮。我們在感染后第4天開始給小鼠喂飲抗生素水以清除效應(yīng)期晚期(6～7天)可能存在細(xì)菌抗原。采用CFU實(shí)驗(yàn)檢測小鼠脾臟內(nèi)細(xì)菌滴度，結(jié)果提示效應(yīng)期晚期細(xì)菌被完全清除。在

12、C3-/-小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮仍有相對于WT明顯減少的差異，表明可以排除效應(yīng)期后期持續(xù)存在的抗原的因素參與調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮的可能性。其次，特異性效應(yīng)CD8+T細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性群體，由各種不同親和力的克隆構(gòu)成。高親和力的克隆比低親和力的克隆更容易分化為短期存活的效應(yīng)細(xì)胞，從而造成隨后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮更多。我們試圖檢驗(yàn)C3-/-和WT小鼠在應(yīng)答高峰期的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的親和力是否存在差異導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞應(yīng)答

13、收縮程度不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C3-/-小鼠和WT小鼠中特異性效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的TCR的Vβ譜無顯著差別，對不同滴度抗原的應(yīng)答靈敏度在兩組中也沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果說明特異性效應(yīng)CD8+T細(xì)胞克隆的親和力與C3調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成無相關(guān)關(guān)系。從分析這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以提示抗原相關(guān)性因素不參與與C3調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成的過程。
　　隨后，我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)答高峰期的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞KLRG-1和CD127表

14、達(dá)在C3-/-小鼠和WT小鼠中有顯著差別。在C3-/-小鼠中有更少的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分化為KLRG-1hiCD127low短期存活的效應(yīng)細(xì)胞(SLECs)和更多的KLRG-1lowCD127hi記憶前體效應(yīng)細(xì)胞(MPECs)。CVF處理后的小鼠在應(yīng)答高峰期效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分化的亞群中KLRG-1hi細(xì)胞占比比對照組顯著減少。這些結(jié)果提示從效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分化的不同比例的SLECs與MPECs與兩組小鼠在隨后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮

15、和記憶形成存在顯著差異有相關(guān)性。已有很多研究支持效應(yīng)期早期APCs提供的細(xì)胞因子第三信號在編程CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成中發(fā)揮主要作用。進(jìn)一步，我們試圖觀察在感染后24小時(shí)的效應(yīng)期早期C3-/-小鼠和WT小鼠中促炎細(xì)胞因子有無差別。我們在實(shí)驗(yàn)中檢測到小鼠血清中IL-12，IFN-γ等促炎細(xì)胞因子水平在C3-/-小鼠中下降明顯。結(jié)合之前的結(jié)果，一種可能的關(guān)于C3如何調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)制的解釋為:C3通過影響早期促炎細(xì)胞因子進(jìn)

16、而調(diào)節(jié)效應(yīng)CD8+T細(xì)胞分化，造成隨后的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成的差別。
　　此外，在很多C3對T細(xì)胞免疫的研究中發(fā)現(xiàn)APC-T細(xì)胞來源的局部C3可通過C5aR發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。最初，我們通過采用C5aR阻斷劑來阻斷C5aR信號通路并觀察李斯特菌感染后的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答動(dòng)力學(xué)變化。結(jié)果顯示C5aR阻斷劑處理組的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成與對照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。更進(jìn)一步，我們采用C5aR敲除小鼠中來觀察C5aR信

17、號通路對特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成的影響，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對照組的特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。這些結(jié)果提示在李斯特感染模型中，C3通過一種不依賴其下游C5aR信號通路的機(jī)制發(fā)揮對CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成的調(diào)節(jié)作用。
　　我們的研究發(fā)現(xiàn)了補(bǔ)體在調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答收縮和記憶形成過程中扮演重要的角色，豐富了補(bǔ)體對于CD8+T細(xì)胞應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)制的認(rèn)識，也加深了天然免疫和適應(yīng)性免疫相互作用的理解。此外