CD8+T細胞免疫壓力下丙型肝炎病毒的適應(yīng)性變異.pdf

1、目的：
　　1.檢測武漢人群中慢性HCV感染患者基因分型,分析基因分型分布及其臨床意義;
　　2.擴增HCV1b型感染患者的HCV NS3區(qū)并進行測序,分析HCV NS3功能區(qū)氨基酸變異和CD8+ T細胞表位內(nèi)外的變異;
　　3.比較中國武漢人群和德國人群HLA頻率分布差異。檢測HCV1b型感染患者HLA分型,并比較分析武漢HCV患者人群與武漢健康人群HLA頻率分布;
　　4.分析HCV1b病毒株序列變異與宿主H

2、LA-I限制性CD8+ T細胞表位變異的相關(guān)性,并針對NS3序列預(yù)測HLA-I限制性CD8+ T細胞表位。
　　方法：
　　1.收集227例武漢慢性HCV感染患者血清和全血,抽提血清中HCV RNA,采用型特異性引物擴增法對HCV RNA進行基因分型,分析武漢人群中HCV基因型別分布,并分析HCV1b型的臨床意義。
　　2.采用巢式PCR對HCV1b基因型的HCV NS3區(qū)進行擴增并測序,采用軟件將HCV1b型患者的H

3、CV NS3區(qū)序列進行序列比,分析HCV NS3功能區(qū)的變異和CD8+ T細胞表位內(nèi)外的變異。
　　3.HLA頻率分布網(wǎng)站中比較中國武漢人群和德國人群的HLA頻率分布。采用型特異性引物PCR法檢測中國武漢HCV1b型患者相應(yīng)的HLA-I(A-和B-位點)等位基因,與武漢健康人群HLA-I等位基因頻率相比較。
　　4.采用ALIGN、DNAMAN等軟件分析武漢HCV1b感染患者中不同 HLA-I限制性的CD8+ T細胞表位的變

4、異頻率。采用網(wǎng)絡(luò)軟件預(yù)測HCV1b型NS3區(qū)序列的HLA-I限制性CD8+ T細胞表位。
　　結(jié)果：
　　1.227份武漢慢性丙肝患者中HCV基因1b型126例(63.6％),其他HCV基因型72例(36.4％),表明在我國慢性丙肝患者HCV主要型別是1b型。比較39例HCV1b型和19例HCV其他基因型別患者肝功能,發(fā)現(xiàn)HCV1b型感染者較其他HCV基因型感染者更容易出現(xiàn)肝功能異常,提示HCV1b型較其他HCV基因型更易造

5、成肝臟損傷。
　　2.對30條HCV NS3區(qū)全長序列進行分析,發(fā)現(xiàn)決定HCV功能的氨基酸序列很難發(fā)生變異,表明HCV NS3功能區(qū)的氨基酸序列相對保守。而且HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位內(nèi)的氨基酸突變頻率明顯大于表位外(p<0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義),提示CD8+ T細胞的免疫壓力是導(dǎo)致HCV NS3變異的重要原因之一。
　　3.比較中國武漢人群和德國人群的HLA-A和HLA-B基因型頻率分布,發(fā)現(xiàn)中國武漢人群中HLA

6、-A02/11/24和HLA-B13/15/46頻率較高。而且中國武漢和德國人群的HLA基因型頻率分布有明顯不同,在武漢人群中分布頻率較高的HLA-A11、HLA-B46基因型頻率在德國人群中明顯較低;而在德國人群中分布頻率較高的HLA-A01、HLA-A03、HLA-B07、HLA-B08基因型頻率在中國武漢人群中較低。分析本研究中135例HCV患者的HLA-A基因型頻率和134例HCV患者的HLA-B基因型頻率,發(fā)現(xiàn)跟中國武漢健康人

7、群的HLA基因型頻率基本一致。
　　4.從群體水平上分析HCV1b型患者HLA-I限制性的HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位突變,發(fā)現(xiàn)兩個HLA-A02陽性的HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位(NS31169-1177和NS31443-1451)突變頻率,明顯高于HLA-A02陰性的HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位突變頻率,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將預(yù)測的HCV1b型患者中HLA-I限制性的HCV NS3區(qū)CD8+

8、T細胞表位與30條HCV NS3全長序列聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)四個預(yù)測的HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位的變異與HLA-I限制性CD8+ T細胞免疫壓力可能有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.武漢人群中主要的HCV病毒株型別是HCV1b型,并且HCV1b型較其他HCV基因型更易造成肝臟損傷。
　　2.決定HCV功能的NS3功能區(qū)氨基酸序列很難發(fā)生變異,而HCV NS3區(qū)CD8+T細胞表位內(nèi)的氨基酸突變頻率明顯大于CD8+ T細胞表

9、位外的氨基酸突變頻率,提示CD8+ T細胞的免疫壓力是導(dǎo)致 HCV NS3變異的重要原因之一。
　　3.武漢和德國人群的HLA基因頻率有明顯不同,在武漢人群中HLA頻率較高比如HLA-A11、HLA-B46在德國人群中明顯較低。武漢人群中頻率較高的HLA-I限制性的HCV CD8+ T細胞表位突變頻率則相對較高。
　　4.兩個NS3區(qū)CD8+ T細胞表位(NS31169-1177和NS31443-1451)跟HLA-A02相

10、關(guān),表明HCV NS3區(qū)CD8+ T細胞表位突變受到宿主HLA等位基因限制。
　　本研究的創(chuàng)新點：
　　1.發(fā)現(xiàn)武漢和德國人群的HLA基因頻率有明顯不同,武漢人群中頻率較高的HLA-I限制性的HCV CD8+ T細胞表位突變頻率相對較高,為找出最佳的HCV抗原序列并研制預(yù)防性和治療性疫苗提供了科學(xué)基礎(chǔ)。
　　2.國內(nèi)既往多項研究集中在HCV的異質(zhì)性和HCV CD8+ T細胞表位預(yù)測,僅少數(shù)研究HLA-I類等位基因與HC