聚合酶δ及其相關(guān)蛋白DNA損傷響應(yīng)機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、DNA在細(xì)胞內(nèi)外各種因素的作用下可不斷產(chǎn)生損傷，如體內(nèi)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基和其它活性化合物，DNA在復(fù)制和重組過(guò)程中自發(fā)的錯(cuò)誤;環(huán)境中的紫外線(xiàn)和離子輻射以及一些化學(xué)物質(zhì)均能損傷DNA。哺乳動(dòng)物通過(guò)主動(dòng)防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)這些DNA損傷，被稱(chēng)為DNA損傷應(yīng)答(DDR)。這一機(jī)制通過(guò)募集或裝備一系列與修復(fù)相關(guān)的蛋白復(fù)合物并激活DNA修復(fù)系統(tǒng)，激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)甚至細(xì)胞凋亡等程序來(lái)應(yīng)對(duì)DNA損傷。而在這些過(guò)程中需要各種各樣的蛋白參與其中，其中也包

2、括DNA聚合酶Polδ。
　　 DNA聚合酶δ是p125，p68，p50，p12四個(gè)亞基構(gòu)成的異源四聚體，屬于DNA聚合酶B家族，具有5'-3'聚合酶催化活性和3'-5'核酸外切酶活性。最新的研究發(fā)現(xiàn)它不僅是染色體DNA復(fù)制過(guò)程中最主要的復(fù)制酶，還參與多種形式的損傷修復(fù)。真核生物體內(nèi)常見(jiàn)的一些修復(fù)途徑如錯(cuò)配修復(fù)、跨損傷合成，堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、雙鏈斷裂修復(fù)等過(guò)程中均涉及Polδ，而且Polδ本身也可能是一個(gè)DNA損傷響

3、應(yīng)的靶目標(biāo)，它通過(guò)p12的降解由四聚體形式轉(zhuǎn)換成三聚體形式應(yīng)對(duì)DNA損傷。目前，對(duì)Polδ參與DNA損傷響應(yīng)的研究已經(jīng)取得了長(zhǎng)遠(yuǎn)的進(jìn)步，但是對(duì)Polδ及其相關(guān)蛋白參與DNA損傷響應(yīng)的機(jī)制還完全不了解，因此本研究以HeLa細(xì)胞為材料，通過(guò)分別加入三種DNA損傷處理劑(HU，MMS，Aphidicolin)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行損傷，并進(jìn)行WesternBlot驗(yàn)證;之后運(yùn)用二維電泳技術(shù)分離并鑒定HU處理8小時(shí)前后HeLa細(xì)胞蛋白表達(dá)譜變化;最后對(duì)差異

4、蛋白進(jìn)行Go分析和KEGGPathway分析，得到的結(jié)果如下:
　　 1.在損傷形成后，p12均會(huì)逐漸降解，其中在HU和MMS處理后，Chk-1會(huì)被磷酸化，從而激活A(yù)TR/Chk1信號(hào)通路。而機(jī)體對(duì)損傷進(jìn)行修復(fù)后，p12又重新回復(fù)。
　　 2.二維電泳后由PDquest軟件分析出的差異蛋白經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定。最終得到35個(gè)表達(dá)變化蛋白，其中表達(dá)上調(diào)蛋白17個(gè)，下調(diào)蛋白18個(gè)。
　　 3.對(duì)差異蛋

5、白的Go分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞定位方面，在處理前后的差異蛋白主要集中在胞內(nèi)區(qū)域;在分子功能方面，處理前后的差異蛋白主要具有綁定和催化的功能;差異蛋白參與最多的是分子過(guò)程和代謝過(guò)程。而KEGGpathway分析表明:表達(dá)水平升高的蛋白，主要參與HumanDiseases通路，表達(dá)下調(diào)的蛋白主要參與metabolism和GeneticInformationProcessing通路。
　　 通過(guò)二維電泳揭示DNA聚合酶Polδ及其相關(guān)蛋白D