神經(jīng)肽P物質(zhì)影響瘢痕中肥大細(xì)胞釋放組胺的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、增生性瘢痕(hypertrophicscar,HS)不僅在形體上損害患者的功能和外貌，而且增生性瘢痕一般都伴有不同程度的瘙癢，有的早期瘢痕瘙癢更是讓病人難以忍受，嚴(yán)重影響患者的日常生活和社會(huì)交往，對(duì)病人的身心健康造成極大的傷害。目前，對(duì)增生性瘢痕瘙癢的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究甚少。主要是沒有可靠的動(dòng)物模型和用于人體的簡便、敏感、可重現(xiàn)的客觀測(cè)癢方法。組胺(histamine)是公認(rèn)的皮膚致癢介質(zhì)[1]，神經(jīng)肽P物質(zhì)(substanc

2、eP,SP)也是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)之一，它是一種致炎性神經(jīng)肽，由感受傷害的C類神經(jīng)纖維轉(zhuǎn)運(yùn)到外周，使肥大細(xì)胞(mastcell，MC)脫顆粒釋放組胺引起皮膚瘙癢[2,3]。為了深入了解組胺與神經(jīng)肽P物質(zhì)在瘢痕瘙癢發(fā)生中所起的作用，初步探討瘢痕瘙癢發(fā)生的機(jī)制，為臨床治療提供新的思路，我們?cè)O(shè)計(jì)并開展了本研究。實(shí)驗(yàn)分六部分：首先對(duì)增生性瘢痕、非增生性瘢痕(non-hypertrophicscar,NHS)和皮膚中組胺與神經(jīng)肽P物質(zhì)進(jìn)行定量、半定量

3、分析；接著在電鏡下觀察肥大細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)在上述三種組織中的區(qū)別；然后將組織中的肥大細(xì)胞分離、培養(yǎng)并鑒定；觀察神經(jīng)肽P物質(zhì)對(duì)分離的肥大胞釋放組胺的影響及G蛋白(Gprotein)mRNA在肥大細(xì)胞的表達(dá)，以探討它與瘢痕瘙癢是否有關(guān)。 第1章.人瘢痕和正常皮膚局部組織中組胺含量的測(cè)定 目的：比較HS、NHS和皮膚局部組織中組胺含量的差別，推測(cè)組胺在人HS瘙癢發(fā)生中的意義。 方法：去除所取標(biāo)本的皮下組織，取等質(zhì)量的全層

4、組織，用高氯酸制成勻漿，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定組胺含量。 結(jié)果：HS組織中組胺的含量明顯高于NHS和正常皮膚[(236.32±26.79)，(170.12±20.53)，(162.31±18.97)ng/g，P＜0.01]，但在NHS和正常皮膚中卻無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：增生性瘢痕局部組織中組胺含量的升高可能與瘙癢有關(guān)。 第2章.P物質(zhì)在人瘢痕和皮膚局部組織中的表達(dá) 目的：比較HS、NHS和皮膚

5、局部組織中SP表達(dá)的差別，推測(cè)SP在人瘢痕瘙癢發(fā)生中的意義。 方法：用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像數(shù)據(jù)分析SP的表達(dá)。 結(jié)果：瘢痕組織全層可見SP的表達(dá)，皮膚中SP則主要表達(dá)在真皮層和表皮基底層。HS中SP的表達(dá)(18.36±3.28PU)明顯強(qiáng)于NHS(13.12±1.22PU)和皮膚(12.75±2.01PU)(P＜0.01)，但在NHS和皮膚中卻無明顯差異(P＞0.05)。另外，HS組織中分布在表皮基底層、小血管內(nèi)膜的

6、SP,其密度也明顯高于正常皮膚，并可見致密的膠原結(jié)締組織間有SP神經(jīng)纖維。 結(jié)論：增生性瘢痕局部組織中SP含量的升高可能與瘙癢有關(guān)。 第3章.人瘢痕和皮膚中肥大細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察 目的：觀察HS、NHS和皮膚局部組織中MC超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其功能狀態(tài)，推測(cè)MC在人HS瘙癢發(fā)生中的意義。 方法：用透射觀察電鏡MC的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：皮膚中MC散布于真皮淺層，瘢痕組織中MC主要分布在瘢痕淺層血管周圍及成纖

7、維細(xì)胞臨近處。皮膚和NHS中MC結(jié)構(gòu)類似，主要呈非活化狀態(tài)；HS中MC數(shù)量多、體積大，多數(shù)呈活化脫顆粒狀態(tài)，并含較多的幼稚MC。 結(jié)論：增生性瘢痕局部組織中大量呈活化脫顆粒狀態(tài)和幼稚MC是瘙癢產(chǎn)生的基礎(chǔ)。 第4章.人瘢痕和皮膚中肥大細(xì)胞的分離和鑒定 目的：分離并鑒定人瘢痕和皮膚組織中MC，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法：用Ⅰ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化分離MC；甲苯胺藍(lán)染色和番紅復(fù)染，鑒定并計(jì)數(shù)MC。 結(jié)果：MC

8、體積大、核呈藍(lán)色，胞漿內(nèi)含紫紅色分泌顆粒。HS中MC占有核細(xì)胞的百分比(8.6±1.9)明顯高于NHS(6.1±1.5)和皮膚(5.3±1.2)(P＜0.01)，但皮膚組與NHS組之間的差異不明顯(P＞0.05)。培養(yǎng)12h后，大部分懸浮細(xì)胞為MC。 結(jié)論：用Ⅰ型膠原酶和透明質(zhì)酸酶可以成功分離皮膚及瘢痕組織中的MC。 第5章.P物質(zhì)對(duì)瘢痕和皮膚中肥大細(xì)胞釋放組胺的影響 目的：探討SP與HS瘙癢發(fā)生的關(guān)系及可能的機(jī)

9、制。 方法：用熒光分光光度法檢測(cè)SP對(duì)分離的MC組胺釋放率的影響，觀察時(shí)間及劑量-效應(yīng)關(guān)系。 結(jié)果：HS中MC的組胺釋放率隨SP刺激時(shí)間的延長和濃度的增加而遞增，與NHS組及皮膚組差異有顯著性(P＜0.01)。 結(jié)論：SP明顯提高HS中MC釋放組胺的水平而產(chǎn)生癢覺，這可能是增生性瘢痕瘙癢發(fā)生的機(jī)制之一。 第6章.G蛋白對(duì)瘢痕和皮膚中肥大細(xì)胞釋放組胺的介導(dǎo) 作用及P物質(zhì)對(duì)G蛋白α亞基mRNA表達(dá)的影

10、響 目的：探討G蛋白在HS瘙癢發(fā)生中可能的作用及SP的作用機(jī)制。 方法：將細(xì)胞分為對(duì)照組、SP刺激組、NEM預(yù)處理+SP刺激組，用熒光分光光度法檢測(cè)組胺釋放率并用RT-PCR法半定量測(cè)定MCs內(nèi)G蛋白α亞基mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果：用G蛋白失活劑NEM預(yù)處理細(xì)胞后，削弱了SP增強(qiáng)MCs分泌組胺的效應(yīng)。HS中GiαmRNA的表達(dá)明顯弱于NHS和皮膚(P＜0.01)，GsαmRNA在上述三種組織中的表達(dá)差異無顯著性(