淋巴細胞在肝細胞癌與癌旁組織中的差異性表達研究.pdf

1、肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC，以下簡稱肝癌）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在惡性腫瘤內(nèi)居第五位，死亡率居第三位。全球每年有60-70萬人死于肝癌，約55％發(fā)生在中國。盡管在過去的幾十年中，在HCC中獲得了很多進展，包括早期發(fā)現(xiàn)、手術(shù)切除、肝移植和分子靶向治療等，但肝癌患者的預(yù)后仍然令人失望，術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率已成為提高HCC遠期療效的瓶頸。近年來研究者逐漸重視從腫瘤微環(huán)境(Tumor Micr

2、oenvironment)角度出發(fā)，探索各種免疫治療手段，試圖改變腫瘤免疫反應(yīng)狀態(tài)，從而探索治療腫瘤的有效干預(yù)手段。大量證據(jù)顯示，HCC是一個典型的炎癥相關(guān)性癌癥，主要受肝炎病毒感染和肝硬化所致，大量炎癥、免疫細胞和相關(guān)分子是腫瘤微環(huán)境的重要組成之一。HCC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后可能受局部的免疫狀態(tài)所決定或影響。就此而言，這些炎癥、免疫細胞和它們所表達的一些關(guān)鍵介質(zhì)，可能為HCC免疫治療提供潛在的靶點。
　　淋巴細胞是腫瘤免疫微環(huán)

3、境的重要組成部分，許多細胞亞群在腫瘤免疫中的作用得到了深入研究與認識:細胞毒性T細胞（CD8+T細胞）、NK細胞(NatureKill cells，NK cells)和NKT細胞(Nature kill T cells，NKT cells)發(fā)揮抑癌免疫效應(yīng)，輔助性T細胞向不同方向分化，如Yh1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg)也可發(fā)揮不同的免疫效應(yīng)。分析淋巴細胞在肝細胞癌與癌旁組織中的基因

4、差異性表達，可能為進一步深入研究與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的基因提供線索，從而為腫瘤的免疫治療提供新的思路和證據(jù)。
　　在本項研究中，我們首先建立并完善了從肝癌及癌旁組織中分離浸潤淋巴細胞的技術(shù)，并用流式細胞術(shù)檢測癌與癌旁浸潤淋巴細胞中主要抗腫瘤效應(yīng)細胞的不同類型及比例，為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。之后，收集了15例HCC癌與癌旁組織的淋巴細胞樣本，進行全基因表達譜芯片的檢測，并對結(jié)果進行分析;主要通過對不同部位（癌與癌旁）、不同的臨床病理特征

5、（腫瘤大小、有無鏡下癌栓）的比較，運用差異基因、通路(Pathway)和基因本體(Gene Ontology, GO)分析比較基因的差異性表達。接著，我們用103例配對HCC癌與癌旁組織中浸潤淋巴細胞樣本，利用實時熒光定量PCR(Real Time PCR, RT-PCR)技術(shù)，對全基因表達譜芯片篩選出的有代表性的40個差異基因進行驗證，并分析與臨床病理特征之間的關(guān)系。最后，我們用324例HCC的組織芯片，采用雙重免疫組織化學(xué)的方法，檢

6、測肝癌和癌旁組織中代表活化狀態(tài)的CD39+Foxp3+ Treg的數(shù)量、比例的差異及與預(yù)后之間的關(guān)系，同時進一步研究了CD39表達情況與預(yù)后的關(guān)系。
　　第一部分肝癌和癌旁組織中浸潤淋巴細胞的分離和鑒定
　　本研究旨在探索肝細胞癌患者外周血及腫瘤局部（肝癌病灶、癌旁肝組織）浸潤淋巴細胞分離方法，并檢測主要的抗腫瘤效應(yīng)細胞的類型及比例。
　　通過不連續(xù)密度梯度離心法分離11例配對肝癌患者外周血單個核細胞（Peripher

7、al Blood Mononuclear cells，PBMCs）、肝癌浸潤淋巴細胞(TumorInfiltrating Lymphocytes，TILs，TL)及癌旁浸潤淋巴細胞（Peritumor InfiltratingLymphocytes，PILs，PL），運用流式細胞技術(shù)檢測不同部位抗腫瘤效應(yīng)細胞的類型及比例差異。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌及癌旁淋巴細胞純度和活力良好（純度＞95％，活力＞90％）。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)癌旁CD3

8、陽性T細胞的比例高于外周血，提示肝組織中成熟T淋巴細胞比例增高。進一步比較CD4陽性T細胞，發(fā)現(xiàn)在外周血中CD3+CD4+CD8-T細胞比例最高（52.47±15.94％），外周血及癌內(nèi)比例高于癌旁(P＜0.001，P=0.001)。癌內(nèi)CD3+CD4-CD8+T細胞在外周血、癌及癌旁比例依次上升（37.45±14.79 vs41.39±13.63 vs56.17±12.21％）。癌旁與外周血、癌旁與癌內(nèi)比例有差異顯著(P=0.003，

9、P=0.003)，癌內(nèi)CD8+T淋巴細胞較癌旁降低，并有CD4/CD8比例倒置(1.585/0.499)。CD3-CD56+ NK細胞癌內(nèi)比癌旁明顯減少（12.66±7.62 vs22.77±13.51％，P=0.026）;CD3+CD56+ NKT細胞在外周血、癌及癌旁比例依次上升（3.35±2.22 vs6.81±5.07 vs16.05±8.52％），癌內(nèi)與癌旁、外周血與癌旁比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001，P=0.006)，

10、癌內(nèi)NK及NKT細胞比例較癌旁低。而CD3+Vα24+ NKT細胞表達外周血比例＜1％，明顯低于癌內(nèi)及癌旁(P=0.045，P=0.041)，癌與癌旁相比無明顯差異。
　　本實驗表明分離的肝癌與癌旁浸潤淋巴細胞純度活力良好，分離方法可行，可用于后續(xù)實驗研究。肝癌局部浸潤淋巴細胞與癌旁相比，存在著CD4/CD8比例倒置、CD8陽性T細胞、NK和NKT細胞的比例下降，提示癌內(nèi)存在著主要抗腫瘤效應(yīng)細胞的比例下降。
　　第二部分全基

11、因表達譜芯片檢測淋巴細胞在肝癌與癌旁組織中的基因差異性表達
　　本研究旨在用全基因表達譜芯片檢測淋巴細胞在肝細胞癌與癌旁組織中的基因差異性表達。
　　通過收集15例配對肝癌和癌旁浸潤淋巴細胞(TL和PL)標本后，進行mRNA抽提及質(zhì)檢合格后，采用全基因表達譜芯片技術(shù)檢測其基因表達，數(shù)據(jù)標準化后進行t檢驗，篩選出倍數(shù)改變(Fold Change)≥2的基因為表達顯著上調(diào)基因，F(xiàn)old Change≤0.5為表達顯著下調(diào)基因（所

12、有差異性基因均滿足P＜0.05）。通過差異基因分析得出Pathway和GO分析結(jié)果。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)15例肝細胞癌中，腫瘤直徑大于5cm者9例(TL1，PL1)，小于等于5cm者6例(TL2，PL2);鏡下癌栓者8例(TL3，PL3)，無癌栓者7例(TL4，PL4)。全基因組表達譜芯片共檢測出19，786個基因的表達水平。TL-PL比較有521個基因上調(diào)，456個基因下調(diào)。TL-PL比較中有“補體與凝血級聯(lián)系統(tǒng)通路”上調(diào)，有“NK細

13、胞介導(dǎo)的細胞毒通路”、“抗原加工與遞呈通路”下調(diào)，GO改變主要集中在固有免疫及殺傷功能的受損。TL1-PL1比較857個基因上調(diào)，827個基因下調(diào)，TL1-TL2比較1501個基因上調(diào)，1282個基因下調(diào)，差異基因數(shù)目在各組別中最多，提示肝癌隨著腫瘤增大，癌與癌旁浸潤淋巴細胞差異的基因表達數(shù)目增加，腫瘤大小對癌內(nèi)浸潤淋巴細胞的差異基因表達影響較大;而TL3-TL4比較僅15個基因上調(diào)，3個基因下調(diào)，PL3-PL4比較7個基因上調(diào)，7個基

14、因下調(diào)。腫瘤較小時，癌與癌旁差異基因集中在“NK細胞介導(dǎo)的細胞毒通路”的下調(diào)。隨著腫瘤增大，激活促炎癥細胞因子基因的“Toll樣受體通路”、“Jak-STAT信號通路”下調(diào)。另外PL1與PL2相比，出現(xiàn)了Th2抗炎細胞因子的上調(diào)(IL4，IL-8)。
　　本實驗表明肝癌與癌旁浸潤淋巴細胞存在著基因差異性表達，主要表現(xiàn)在“補體與凝血級聯(lián)系統(tǒng)通路”上調(diào)及“NK細胞介導(dǎo)的細胞毒通路”、“抗原加工與遞呈通路”的下調(diào)，并有固有免疫及殺傷功能

15、的受損。腫瘤大小對癌與癌旁浸潤淋巴細胞的差異基因表達影響較大。腫瘤較小時，腫瘤內(nèi)出現(xiàn)免疫效應(yīng)細胞的功能下降，隨著腫瘤進展，激活促炎癥細胞因子的通路下調(diào)伴隨癌旁Th2抗炎細胞因子的上調(diào)。
　　第三部分肝癌和癌旁組織中的浸潤淋巴細胞差異性表達基因的驗證
　　本研究旨在對全基因表達譜芯片篩選出的淋巴細胞在肝癌與癌旁組織中的差異性表達基因進行RT-PCR驗證。
　　收集2012年5月～2013年9月期間肝細胞癌手術(shù)標本103例

16、，進行癌與癌旁浸潤淋巴細胞的分離;運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測全基因表達譜芯片篩選出的癌與癌旁浸潤淋巴細胞具有代表性的40個差異性表達基因，并結(jié)合患者的臨床病理資料進行分析，進一步驗證基因芯片的可靠性和可重復(fù)性。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)所驗證的基因中36個（≥90％）顯示出與全基因表達譜芯片一致的上調(diào)和下調(diào)趨勢，這些編碼重要分子的基因涉及效應(yīng)細胞的殺傷功能(FASL和PRF1)及NK細胞毒通路(CD244和NKG2D等)、浸潤淋巴細胞的轉(zhuǎn)

17、錄活化分子(EOMES，TBX21和TXK等)、共信號分子及受體（TNFRSF11A和CTLA4）、細胞因子、趨化因子及受體和整合素（IL8，XCL1和ITGAV等）及細胞表面抗原和其他免疫相關(guān)分子（CD160和BCOR等）。其中大部分基因表達與腫瘤大小、數(shù)目、分化、包膜、血管侵犯、分期、AFP分級、GGT分級其中一個或以上臨床病理資料明顯相關(guān)。
　　本研究表明淋巴細胞在肝癌與癌旁組織中的存在著多種免疫相關(guān)基因的差異性表達，這些差

18、異表達基因主要集中在效應(yīng)細胞的殺傷功能、轉(zhuǎn)錄活化分子、共信號分子及受體、細胞因子、趨化因子及受體和整合素等。全基因表達譜芯片結(jié)果具有可靠性和可重復(fù)性。
　　第四部分肝癌和癌旁組織中的CD39+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的差異表達及與預(yù)后關(guān)系研究
　　探討CD39+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Treg細胞)在肝細胞癌及癌旁的差異表達及與預(yù)后關(guān)系，并探討CD39在肝癌的表達情況與預(yù)后關(guān)系。

19、>　　通過雙重免疫組織化學(xué)染色，分析CD39+Foxp3+ Treg在324例肝細胞癌患者癌及癌旁組織中的數(shù)目及CD39+Foxp3+/ Foxp3+比例差異，進一步分析癌內(nèi)CD39+Foxp3+數(shù)目與肝癌患者預(yù)后關(guān)系;通過免疫組織化學(xué)染色，蛋白免疫印跡方法，研究CD39在腫瘤不同細胞上的表達，并探討其表達情況與預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)Foxp3+Treg和CD39+Foxp3+ Treg在癌內(nèi)數(shù)目明顯高于癌旁(14.17vs4

20、.99，P=0.001;11.53 vs3.39; P＜0.001)， CD39+Foxp3+/Foxp3+Treg的比例在癌內(nèi)高于癌旁(83.34 vs79.19％，P=0.013)。單因素分析肝癌內(nèi)浸潤Foxp3+和CD39+Foxp3+Treg高浸潤組至復(fù)發(fā)時間(Time to recurrence，TTR)和總體生存率(Overall Survival, OS)均低于低浸潤組（TTR，P=0.030和P=0.029; OS，P=

21、0.024和P=0.014）。而癌旁Foxp3+Treg高浸潤組術(shù)后復(fù)發(fā)時間低于低浸潤組(TTR，P=0.024)。多因素分析顯示癌Foxp3+和CD39+Foxp3+ Treg是肝癌患者OS的獨立預(yù)測指標(P=0.035和P=0.019)。癌旁Foxp3+Treg亦可作為術(shù)后復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測指標(P=0.021)。進一步研究發(fā)現(xiàn)CD39在肝癌內(nèi)表達廣泛，血管內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞及上都有表達，癌內(nèi)CD39表達明顯高于癌旁(0.05

22、52 vs0.0387，P＜0.001)。單因素預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，肝癌內(nèi)CD39高表達組TTR和OS均低于低浸潤組(P=0.009和P=0.005)，多因素分析顯示肝癌內(nèi)CD39表達是預(yù)后的獨立因素（TTR,P=0.033; OS，P=0.021）。而癌旁CD39高表達與術(shù)后高復(fù)發(fā)率相關(guān)（單因素P=0.001;多因素P=0.003）。
　　本研究表明肝癌中CD39+Foxp3+ Treg數(shù)目及CD39+Foxp3+/Foxp3+ Tr

23、eg比例較癌旁明顯增高，浸潤數(shù)目與肝癌總體生存率相關(guān)。肝癌局部存在著CD39的高表達、廣泛表達并與術(shù)后復(fù)發(fā)及總生存率相關(guān)。
　　結(jié)論
　　1肝癌浸潤淋巴細胞與癌旁組織中淋巴細胞相比，存在著CD4/CD8倒置、CD8陽性T細胞、NK和NKT細胞的比例下降，提示肝癌內(nèi)主要抗腫瘤效應(yīng)細胞的比例下降。
　　2淋巴細胞在肝癌和癌旁組織中存在著基因的差異性表達，主要表現(xiàn)在“補體與凝血級聯(lián)系統(tǒng)通路”上調(diào)及“NK細胞介導(dǎo)的細胞毒通路”

24、、“抗原加工與遞呈通路”的下調(diào)，并有固有免疫及殺傷功能的受損。腫瘤大小對癌與癌旁浸潤淋巴細胞的差異基因表達影響較大。
　　3肝癌與癌旁組織中浸潤的淋巴細胞存在著多種免疫相關(guān)基因差異表達，這些差異表達基因主要集中在效應(yīng)細胞的殺傷功能、轉(zhuǎn)錄活化分子、共信號分子及受體、細胞因子、趨化因子及受體和整合素等。全基因表達譜芯片結(jié)果具有可靠性和可重復(fù)性。
　　4肝癌中CD39+Foxp3+ Treg數(shù)目及CD39+Foxp3+/Foxp3

25、+ Treg比例較癌旁明顯增高，浸潤數(shù)目與肝癌總體生存率相關(guān)。肝癌局部存在著CD39的高表達、廣泛表達并與術(shù)后復(fù)發(fā)及總生存率相關(guān)。
　　創(chuàng)新點
　　1首次用分離出的肝癌及癌旁組織中的浸潤淋巴細胞做全基因表達譜芯片，進一步分析兩者的基因差異性表達，并篩選出與肝癌浸潤淋巴細胞功能改變相關(guān)的差異表達基因予以驗證，為進一步研究提供實驗依據(jù)。
　　2首次闡明肝癌內(nèi)CD39+Foxp3+ Treg表達情況及與預(yù)后的關(guān)系;闡明CD3