肝細胞癌患者外周血及癌組織中CD4+Foxp3+調節(jié)性T淋巴細胞增多的相關機制研究.pdf

1、調節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cell，Treg)是一類具有免疫抑制作用的淋巴細胞亞群，占正常人外周血中CD4+T淋巴細胞亞群的5-10％。Treg細胞最早由日本科學家Sakaguchi于1995年首先報道，并且迅速成為免疫學研究的熱點之一。Treg細胞的主要表面標志物為CD4、CD25，而胞核標志物為Foxp3。Foxp3對于Treg細胞的分化、發(fā)育以及發(fā)揮免疫抑制功能具有重要作用。自Treg細胞被發(fā)現(xiàn)之后多種自身免疫系

2、統(tǒng)疾病如類風關（rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)等都被認為與該群細胞功能受損或者數(shù)量減少有關。而正是由于Treg細胞所特有的負免疫調節(jié)作用也吸引了越來越多研究者的目光。近年來的研究表明腫瘤組織當中Treg細胞含量的高低與腫瘤患者的愈后密切相關，特別是在肝細胞癌(hepatocell

3、ular carcinoma, HCC)患者當中Treg細胞含量越高者其愈后往往越差。而動物實驗以及一些Ⅱ期臨床實驗表明特異性的清除Treg細胞可以明顯抑制腫瘤生長甚至是使腫瘤完全消退。這表明Treg細胞所介導的免疫抑制作用有可能是導致癌細胞成功逃避機體免疫監(jiān)視進而發(fā)生遠處轉移的重要原因之一。因此本研究的目的在于明確HCC誘導Treg細胞生成的分子機制并進一步探討其在HCC治療過程當中的潛在價值。本論文分成三部分加以討論。
　　第

4、一部分肝細胞癌患者外周血及癌組織中CD4+Foxp3+調節(jié)性T淋巴細胞的含量與預后的關系
　　我們首先使用流式細胞技術對HCC患者外周血中CD4+Foxp3+ Treg細胞含量進行檢測，并同慢性乙肝后肝硬化患者及正常人外周血中的Treg細胞進行對比。通過對比我們發(fā)現(xiàn)HCC患者及慢性乙肝后肝硬化患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞含量較正常人均明顯增加，但HCC患者與慢性乙肝后肝硬化患者外周血中Treg細胞含量并無明顯差異。

5、接下來我們使用免疫組化技術對151例HCC患者手術切除標本進行染色，通過免疫組化我們發(fā)現(xiàn)絕大部分Foxp3+細胞位于癌組織邊緣，僅有少部分陽性細胞發(fā)現(xiàn)于癌旁及癌組織中心部位。根據(jù)癌組織當中陽性細胞的個數(shù)由低到高將151例手術患者進行排列，取中位數(shù)將該隊列分為低表達組（75例）和高表達組（76例）。隨后使用Cox風險比例模型對HCC患者術后總生存期(overall survival，OS)和無瘤生存期(disease free survi

6、val，DFS)相關危險因素進行單因素和多因素方差分析。結果顯示，除腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜等因素與患者的生存和腫瘤復發(fā)相關外，癌組織中Foxp3+細胞數(shù)目也是患者預后的獨立危險因素。這一部分研究提示，癌組織中Treg細胞數(shù)目的多少是預測HCC患者預后的重要標志物。因此明確HCC誘導Treg細胞生成的相關分子機制有可能為HCC的治療提供潛在的治療靶點。
　　第二部分肝癌細胞分泌TGF-β1誘導外周血及癌組織中CD4+CD25-

7、T淋巴細胞向調節(jié)性T淋巴細胞轉化的相關機制研究
　　在前一部分中我們發(fā)現(xiàn)HCC和Treg細胞關系密切，并且高表達Treg細胞的HCC患者其預后較差，在本節(jié)中我們主要探討肝細胞癌如何誘導Treg細胞產生。前人的研究表明TGF-β1是誘導幼稚CD4+T細胞向Treg細胞轉化的重要細胞因子，通過免疫熒光和免疫組化我們發(fā)現(xiàn)肝癌細胞具有分泌TGF-β1的功能，這表明腫瘤有可能通過分泌TGF-β1來誘導外周血及癌組織中的幼稚CD4+T細胞向T

8、reg細胞轉化。接下來我們使用磁珠將小鼠脾臟和淋巴結中的CD4+CD25-細胞分離并使用小鼠肝細胞癌Hepa1-6培養(yǎng)上清在抗CD3/CD28 beads的刺激下體外培養(yǎng)3天后通過流式細胞儀、Western blot和real-time PCR來檢測其中Foxp3表達情況，發(fā)現(xiàn)在加入HCC細胞培養(yǎng)上清液后4.66％的CD4+T細胞表達Foxp3而對照組只有1.69％細胞表達。為證明HCC細胞分泌的TGF-β1是誘導Treg細胞產生的主要

9、因子，我們首先使用慢病毒轉染技術建立了TGF-β1 knockdownHepa1-6(shRNA-TGF-β1-Hepa1-6)穩(wěn)轉細胞并收集上清液，同時使用TGF-βreceptorⅠ磷酸化酶抑制劑及recombinant TGF-β1分別培養(yǎng)磁珠分選的CD4+CD25-T細胞。結果表明在使用了shRNA-TGF-β1-Hepa1-6細胞的培養(yǎng)上清液和TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑后腫瘤上清誘導CD4+CD25-T細胞向

10、Treg細胞轉化的功能受到顯著抑制，而在TGF-β1 knockdown細胞的培養(yǎng)上清液加入重組的TGF-β1則可以顯著的增加CD4+CD25-細胞向Treg細胞轉化的能力。我們還同時發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞培養(yǎng)上清液對Treg細胞的誘導作用具有時間依賴性，其在3天時誘導的Treg細胞比例最高。上述結果表明腫瘤細胞分泌的TGF-β1是誘導幼稚CD4+T細胞向Treg細胞轉化的重要細胞因子。接下來我們將Hepa1-6，scramble和shRNA-T

11、GF-β1-Hepa1-6細胞分別接種于小鼠肩胛部位，2周后處死小鼠并取出腫瘤制成蠟塊，切片后免疫組化檢測其中Foxp3+細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)在shRNA-TGF-β1-Hepa1-6組腫瘤內Treg細胞數(shù)目明顯減少。我們同時使用上述三株細胞進行小鼠尾靜脈注射4周后處死小鼠檢測其脾臟中Treg細胞數(shù)目，與上述結果類似shRNA-TGF-β1-Hepa1-6組小鼠脾臟中的Treg細胞數(shù)目明顯減少。在本節(jié)中我們通過體內外實驗詳細闡述了肝細胞癌通過分

12、泌TGF-β1誘導CD4+CD25-T細胞向Treg細胞轉化的具體機制，為破解HCC如何逃避機體免疫監(jiān)控提供了詳實的證據(jù)。
　　第三部分肝細胞癌分泌的TGF-β1對淋巴細胞功能和癌細胞自身增殖能力的影響及相關機制的探討
　　和對照組相比recombinant TGF-β1和Hepa1-6細胞培養(yǎng)上清能夠顯著抑制CD8+T細胞分泌IFN-γ并且能夠抑制DCs細胞成熟，而在kncokdown TGF-β1后上述抑制效應明顯減弱。

13、通過構建shRNA-TGF-β1-Hepa1-6細胞株我們發(fā)現(xiàn)在knockdown TGF-β1基因后Hepa1-6細胞增殖速度明顯減慢，這表明HCC細胞分泌的TGF-β1不僅對癌組織中的淋巴細胞產生影響，同時還會對癌細胞自身的增殖發(fā)揮作用。為了探討HCC細胞分泌的TGF-β1對癌細胞自身的影響，我們首先進行平板克隆實驗，實驗發(fā)現(xiàn)在使用TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑以后肝癌細胞形成克隆的能力明顯增強，這表HCC細胞分泌的T

14、GF-β1對自身的增殖具有抑制作用，而在knockdown TGF-β1后Hepa1-6細胞形成克隆的能力顯著下降，這表明TGF-β1不但具有抑制細胞增殖的作用，還可以促進細胞增殖。通過流式檢測我們發(fā)現(xiàn)在阻斷TGF-β receptorⅠ介導的下游信號通路以后G1期細胞減少而S期細胞增多，而在knockdown TGF-β1后G1期細胞增多S期細胞減少，并且knockdown TGF-β1引起Hepa1-6細胞早期凋亡增加。這表明TGF

15、-β1有可能通過控制細胞周期來達到調控細胞增殖的目的。接下來我們利用Western blot檢測了與細胞周期相關的一些蛋白如c-myc、cyclin D3、CDK4等，結果發(fā)現(xiàn)在使用TGF-β receptorⅠ磷酸化酶抑制劑后除CDK4外上述調控細胞周期的相關蛋白顯著增加，而敲除TGF-β1基因后其含量則明顯下降，這表明肝癌細胞可以通過分泌TGF-β1調節(jié)其自身的增殖速度。接著通過動物實驗我們發(fā)現(xiàn)在knockdown TGF-β1后H

16、epa1-6的成瘤能力明顯減弱，小鼠的生存時間顯著延長。上述實驗表明肝癌細胞分泌的TGF-β1不僅抑制淋巴細胞的功能對HCC細胞本身具有雙重作用，抑制TGF-β1的分泌有可能為肝癌治療提供新的靶點。
　　綜上所述，肝細胞癌能夠通過分泌TGF-β1誘導CD4+CD25-淋巴細胞向具有負免疫調節(jié)作用的Treg細胞轉換，而Treg細胞反應了患者體內的免疫抑制狀態(tài)，癌組織內過高的Treg細胞是患者預后較差的獨立危險因素。另一方面，HCC細