口腔癌患者手術前后外周血中CD4+CD25+FOXP3調節(jié)性T細胞的檢測及其臨床意義.pdf

1、目的：口腔癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在全身惡性腫瘤中其排在第六位（位于肺、胃、乳腺、直腸以及宮頸癌之后），近些年來世界范圍內口腔癌的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，該病每年的新發(fā)數(shù)超過50萬。我國人口眾多，屬于口腔癌高發(fā)地區(qū)，其中常見的有舌癌、牙齦癌、頰癌等，其發(fā)病原因到目前尚未完全明確，可能是由多種綜合性的因素引起，如精神方面、環(huán)境方面以及免疫方面等因素。如今，眾多學者已經開始密切關注并著手研究免疫方面的因素。通過相關研究證明，無論是早期

2、還是晚期的口腔癌病人，其免疫功能均可能比正常人群出現(xiàn)下降，然而在晚期患者中則更為明顯。所以，在口腔惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中人體的免疫功能狀態(tài)變化可能具有相關的參考價值。近年來研究發(fā)現(xiàn)，具有免疫調節(jié)功能的一類T細胞，即CD4+CD25+調節(jié)性T細胞，(regulatoryTcells，Tregs)在抗腫瘤免疫過程中起著非常重要的作用，它可以通過下調人體內的免疫應答水平，來減弱宿主的抗腫瘤免疫作用，從而成為當今醫(yī)學領域研究的熱點。還有相關

3、的研究表明，F(xiàn)OXP3主要存在于活化的CD4+CD25+T淋巴細胞表面，對其發(fā)育及功能的發(fā)揮起了相當重要的作用。本實驗目的在于通過流式細胞學技術，來精確檢測口腔癌患者手術前、后外周血中T淋巴細胞各種亞型和CD4+CD25+Treg的表達情況，并通過分析口腔癌病人血中CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3的表達水平與其細胞免疫的狀態(tài)、手術對上述淋巴細胞表達水平的影響，從而更加深入的探討其與口腔癌病人手術前后免疫狀況的關系和臨床意

4、義，在口腔癌的免疫治療中提供可靠的理論依據(jù)。
　　 方法：取100μl每份的靜脈血共8份，各自加入10μl由FITC標注的CD3單克隆抗體和CD4單克隆抗體；由PE標注的CD8及CD56單克隆抗體各10μl;10μl由PE標注的Fas單克隆抗體；由FITC標注的CD4單克隆抗體以及PE標注的Fas單克隆抗體各10μl;10μl由PE標注的FasL單克隆抗體；由FITC標注的CD4單克隆抗體與PE標注的FasL單克隆抗體各10μl

5、;在室溫條件下孵育1小時并且避光，然后再加入紅細胞裂解液，使紅細胞裂解5分鐘，再加入PBS液以便清除血紅蛋白，在1mlPBS液內使其重新懸浮，最后T淋巴細胞各表型采用流式細胞儀檢測其百分比，以及CD4+Fas+和CD4+FasL+T細胞所占比例，F(xiàn)asL+及Fas+T細胞的百分比，并得出CD4+與CD8+的比值。另外再取2份100μl的靜脈血，分別加入20μl由FITC標注的CD4單克隆抗體，20μl由APC標注的CD25單克隆抗體，同

6、樣是避光在室溫下孵育1小時，再加入紅細胞裂解液以便裂解紅細胞5分鐘，用PBS液祛除其內的血紅蛋白，再次懸浮在1mlPBS液內，然后加入10μl由PE標注的FOXP3，再次避光室溫下孵育1小時，最后使用流式細胞儀測出CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3 T細胞的比例。
　　 結果：
　　 1.口腔癌患者各項免疫指標在手術前后的變化
　　 1.1 口腔癌患者術前外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD5

7、6+T淋巴細胞所占比例分別為56.43±9.44％，29.54±4.88％，31.42±10.95％，21.43±6.03％，CD4+/CD8+比值范圍為0.91±0.32;健康對照組外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+T淋巴細胞所占比例分別為68.81±6.55％,42.50±7.56％,24.77±6.25％，11.78±2.87％，CD4+/CD8+比值范圍為1.73±0.56。
　　 1.2 口腔癌患者經手術

8、治療，一周后再次采集其外周血，檢測外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+T淋巴細胞所占比例分別為67.65±2.64％，41.05±4.92，25.06±3.38％，15.81±2.31％，CD4+/CD8+比值范圍為1.59±0.18。術后CD3的表達較術前明顯提高，存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；其與健康對照組相比，不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，可以認為CD3的表達與健康對照組的差別沒有顯著性；CD4的表達水平在術后與

9、術前相比有明顯提高，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但與健康對照組相比則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CD8的表達術后比術前明顯降低(P＜0.05)，同時與正常對照組之間的差別無顯著性(P＞0.05);CD4/CD8比值術后與術前相比明顯回升，且與正常對照組無顯著性差異(P＞0.05);CD56的表達術后明顯低于術前(P＜0.05)，與對照組比相則無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.手術前后口腔癌患者外周血中Fas、FasL

10、的變化口腔癌病人手術前外周血中CD4+FasL+、CD4+Fas+、FasL+、Fas+T淋巴細胞所占的比例分別是22.65±7.02％，29.22±5.19％，0.60±0.24％和36.05±6.28％，術后值則為：28.80±7.53％，24.58±7.25％，0.92±0.34％和37.93±5.65％;CD4+FasL+，F(xiàn)asL+和Fas+的表達水平術后較術前有明顯提高(P＜0.05)，CD4+Fas+的表達術后比術前明顯降

11、低(P＜0.05)。
　　 3.手術前后口腔癌病人外周血中的CD4+CD25+T細胞以及CD4+CD25+FOXP3T細胞的變化
　　 3.1 術后口腔癌患者外周血中CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25+FOXP3T細胞所占的比例分別為30.93±3.55％和65.34±3.43％。CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3T細胞的表達水平較術前都明顯降低，存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但均高于正常對照組(

12、P＜0.05)。
　　 3.2 不同臨床因素與CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3表達的關系
　　 3.2.1 CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3在口腔癌病人外周血中的表達顯著較正常對照組高(P＜0.05)，其水平在Ⅲ+Ⅳ期患者中遠遠高于Ⅰ和Ⅱ期患者(P＜0.05)；口腔癌病人伴有淋巴結轉移者CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3 T細胞的表達顯著高于無淋巴結者(P＜0.05)。

13、>　　 3.2.2 年齡大小、性別、吸煙與否等因素與口腔癌患者外周血中CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3的表達無明顯相關性。
　　 結論：
　　 1.與健康人相比較，口腔癌患者的輔助性T淋巴細胞表達水平降低，抑制性T淋巴細胞表達則升高，機體的免疫功能出現(xiàn)不同程度降低的情況，通過手術去除瘤負因素后，可以在一定程度上解除機體內免疫功能受到的抑制，所以手術對口腔癌患者的治療是有效的。
　　 2.對口腔癌

14、患者來說，其外周血中Fas和FasL的表達水平或許可以成為評估口腔癌病人治療過程中評價人體免疫功能的一個免疫學指標。
　　 3.對于口腔癌患者來說，其外周血中CD4+CD25+和CD4+CD25+FOXP3表達水平可能均與惡性腫瘤分期以及出現(xiàn)淋巴結轉移相關。
　　 4.手術切除腫瘤1周，外周血中CD4+CD25+FOXP3表達水平較術前明顯下降，可考慮減少瘤負因素后，機體的免疫抑制情況減輕，從而使免疫功能有所恢復。