缺氧預(yù)適應(yīng)上調(diào)心肌細(xì)胞DJ-1表達及其信號機制研究.pdf

1、目的:建立H9c2心肌樣細(xì)胞急性缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷模型及缺氧預(yù)適應(yīng)(APC)延遲保護模型,運用多種經(jīng)典、公認(rèn)的生理、生化等檢測指標(biāo),在確認(rèn)模型已成功的基礎(chǔ)上,采用RT-PCR、Western Blotting等分子生物學(xué)檢測方法來探討DJ-1的表達及變化規(guī)律,以期闡明APC所產(chǎn)生的延遲保護與DJ-1蛋白表達的關(guān)系,并從ERK1/2信號通路的角度初步探討APC上調(diào)DJ-1表達的信號機制。
　　 方法:采用H9c2心肌樣細(xì)胞,

2、隨機分為五組:①Control組,②U0126+Control組,③A/R組,④APC組,⑤U0126+APC組。通過RT-PCR和Western blotting技術(shù)分別檢測各實驗組中DJ-1 mRNA及蛋白的表達情況,同時用Westernblotting檢測ERK1/2蛋白的磷酸化水平；并利用MTT法檢測各實驗組的細(xì)胞存活率;按試劑盒說明測定各組細(xì)胞內(nèi)LDH的活性,MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-Px的活性；另外通

3、過流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量變化。
　　 結(jié)果:H9c2細(xì)胞經(jīng)A/R處理后,細(xì)胞存活率明顯下降、LDH活性增加、細(xì)胞內(nèi)MDA及ROS含量顯著增加,抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px的酶活性下降,與Control組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),表明H9c2細(xì)胞A/R處理出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷。而經(jīng)APC處理的H9c2細(xì)胞,24 h后可顯著提高A/R損傷細(xì)胞的存活率、降低A/R損傷細(xì)胞的LDH活性,同時降低A/R

4、損傷細(xì)胞內(nèi)MDA及ROS含量、增加A/R損傷細(xì)胞內(nèi)抗氧化物SOD、CAT、GSH-Px的酶活性,表明缺氧預(yù)適應(yīng)能對抗A/R所誘發(fā)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生延遲保護。此外APC在對抗A/R所誘發(fā)的氧化應(yīng)激產(chǎn)生延遲保護作用的同時,能促進ERK1/2蛋白磷酸化、上調(diào)DJ-1 mRNA及蛋白的表達水平,并且APC誘導(dǎo)DJ-1表達變化與APC延遲保護出現(xiàn)的時間窗相一致；但APC前預(yù)先給予ERK1/2抑制劑U0126,則APC上調(diào)DJ-1表達的效應(yīng)被取消,同時