基于Nrf2-ARE信號途徑探討DJ-1抗心肌細胞缺氧-復氧所誘發(fā)氧化應激損傷的分子機制.pdf

1、目的：
　　應用基因轉染及RNA干擾等分子生物學手段，從Nrf2-ARE信號通路的角度探討DJ-1上調H9c2心肌樣細胞內(nèi)抗氧化酶（MnSOD、CAT、GSH-Px）的表達，對抗缺氧/復氧（H/R）所誘發(fā)的氧化應激損傷的分子機制。
　　方法：
　　1、H9c2心肌樣細胞分別經(jīng)DJ-1 siRNA、陰性對照siRNA（NC siRNA）、pFlag-DJ-1重組載體及其相應的對照空質粒pFlag瞬時轉染24 h后，通過W

2、estern blot檢查DJ-1蛋白、抗氧化酶MnSOD、CAT、GPx蛋白表達的變化，以求觀察DJ-1不同表達水平對H9c2細胞內(nèi)抗氧化酶MnSOD、CAT、GPx蛋白表達的影響。
　　2、H9c2心肌樣細胞分別經(jīng)DJ-1 siRNA、NC siRNA、pFlag-DJ-1、pFlag瞬時轉染24 h后，建立H/R模型，通過檢測以下變化，探討DJ-1不同表達水平對H/R所誘發(fā)的氧化應激損傷的影響：①MTT法檢測各組心肌細胞存活

3、率的變化；②利用試劑盒檢測各組細胞內(nèi)LDH活性的變化；③應用比色法測定MDA含量的變化；④流式細胞術檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的變化。
　　3、H9c2心肌樣細胞分別經(jīng)DJ-1 siRNA、NC siRNA、pFlag-DJ-1、pFlag瞬時轉染24 h后，通過檢測以下變化，觀察DJ-1不同表達水平對H9c2細胞內(nèi)Nrf2信號通路的影響：①Western Blot檢測細胞內(nèi)DJ-1蛋白表達的變化；②免疫共沉淀（Co-IP）檢

4、測Nrf2-Keap1的解離情況；③Western Blot檢測Nrf2核轉位變化；④染色質免疫共沉淀（ChIP）法檢測胞核內(nèi)Nrf2與MnSOD、CAT及GPx基因啟動子區(qū)內(nèi)抗氧化反應元件（ARE）結合的變化；⑤采用熒光素酶報告基因實驗檢測Nrf2的轉錄活性的變化。
　　4、H9c2心肌樣細胞經(jīng)pFlag-DJ-1或pFlag瞬時轉染24 h后，再分別用Nrf2 siRNA或NC siRNA轉染24 h，隨后，采用Western

5、 Blot檢測細胞內(nèi)Nrf2及抗氧化酶（MnSOD、CAT、GPx）蛋白表達的變化，以此來觀察抑制Nrf2信號通路對DJ-1所介導的H9c2細胞內(nèi)MnSOD、CAT、GPx蛋白表達上調的影響。
　　5、H9c2心肌樣細胞經(jīng)pFlag-DJ-1或pFlag瞬時轉染24 h后，再分別用Nrf2 siRNA或NC siRNA轉染24 h，隨后，建立H/R損傷模型，通過檢測以下方面變化，觀察Nrf2信號通路的抑制對DJ-1抗H/R所誘發(fā)的

6、氧化應激影響：①應用MTT法來檢測實驗各個組心肌細胞存活率的變化；②利用試劑盒檢測各個組細胞內(nèi)LDH活性變化；③采用比色法來測定MDA含量的變化；④流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS含量的變化。
　　結果：
　　1、H9c2轉染 pFlag-DJ-1后 DJ-1蛋白水平明顯提高，細胞內(nèi)抗氧化酶MnSOD、CAT及GPx蛋白表達水平均顯著上調；同時，pFlag-DJ-1轉染可明顯的提高 H/R損傷心肌細胞的生存率，且抑制 LDH的活性

7、；并能夠明顯的減少H9c2心肌細胞H/R的過程中所生成的ROS，減少MDA產(chǎn)生。然而在siRNA干擾H9c2細胞內(nèi)DJ-1蛋白表達后，上述效應被逆轉，提示DJ-1能誘導細胞內(nèi)抗氧化酶MnSOD、CAT及GPx的表達，對抗H/R所誘發(fā)的氧化應激損傷。
　　2、在pFlag-DJ-1轉染的H9c2細胞，胞質內(nèi)Nrf2與Keap1的結合減少，Nrf2入核增加、并與核內(nèi)SOD、CAT及GPx基因區(qū)的ARE的結合加強，同時Nrf2的轉錄活性

8、明顯增加；而在 DJ-1 siRNA轉染的 H9c2細胞， DJ-1沉默對Nrf2-Keap1的解離及隨后Nrf2的入核、與ARE的結合及其轉錄活性均呈現(xiàn)顯著地抑制效應。這些結果提示DJ-1在心肌細胞能促進Nrf2信號通路的激活。
　　3、H9c2細胞經(jīng)Nrf2 siRNA轉染抑制Nrf2信號通路后，DJ-1高表達上調抗氧化物酶SOD、CAT、GPx蛋白表達，對抗H/R所誘發(fā)的氧化應激損傷的效應均被逆轉，提示Nrf2-ARE信號通