龍血素A抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的研究.pdf

1、背景與目的:
　　心血管疾病是最常見的非傳染性疾病之一(NCD)，好發(fā)年齡段在35-50歲之間，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增高。在更年期中，女性發(fā)病率是男性的3-4倍。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，全球范圍內(nèi)，每年因心血管疾病死亡的人數(shù)達(dá)970萬(wàn)人之多，占全球死亡人數(shù)的30％?；颊呙磕曛委熜难芗膊〉馁M(fèi)用居所有疾病之首，不僅加重了人民的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而且造成人民生活水平的下降。
　　氧化應(yīng)激(Oxidative Stress，OS)作為心血管

2、的錯(cuò)綜復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制之一，與其他病理生理機(jī)制互相并存，交叉影響，直接或間接的導(dǎo)致心肌損傷、心律失常、心肌肥厚等心血管疾病的發(fā)生。隨著天然抗氧化劑的研究得到不斷重視，黃酮類化合物抗氧化劑由于其顯著的抗氧化活性而成為備受關(guān)注的天然活性產(chǎn)物之一。龍血素A(Loureirin A)是一種存在于龍血竭中的二氫黃酮類化合物。近現(xiàn)代研究表明，龍血竭具有多方面生物藥理活性包括心血管保護(hù)，抗菌，免疫抑制，止血活血的雙向調(diào)節(jié)，抗炎，鎮(zhèn)痛，降血糖和血脂，促進(jìn)

3、皮膚修復(fù)和抗氧化等。鑒于此，本研究將利用小鼠心肌細(xì)胞H9c2，模擬體內(nèi)氧化應(yīng)激模型，設(shè)計(jì)出與臨床及其相關(guān)的體外實(shí)驗(yàn)體系，通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)及手段，從細(xì)胞分子層面揭示龍血竭中的有效成分Loureirin A在小鼠心肌細(xì)胞H9C2氧化應(yīng)激損傷過(guò)程的保護(hù)作用。以龍血竭在心血管疾病臨床治療中的應(yīng)用為目的，奠定科學(xué)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚摶A(chǔ)。
　　方法:
　　(1)采用CCK-8法測(cè)定叔丁基過(guò)氧化氫(ter-butyl hydroperoxide

4、，TBHP)對(duì)H9c2細(xì)胞活力的影響及龍血素A、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)對(duì)TBHP誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞活力下降的抑制作用，并且比較龍血素A和N-乙酰-L-半胱氨酸抗氧化損傷的保護(hù)作用。
　　(2)采用紫外線分光光度計(jì)(ultraviolet spectrophotometer)測(cè)定龍血素A對(duì)TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性的影響。
　　(3)采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和流式

5、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)龍血素A對(duì)TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率的影響。
　　(4)采用PCR檢測(cè)龍血素A對(duì)TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白BaxmRNA及Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響。
　　(5)采用Western blotting檢測(cè)龍血素A對(duì)TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)建立0.4μM TBHP刺激H9c2細(xì)胞6小時(shí)為氧化應(yīng)激損傷模型且龍血素A在

6、濃度低于500nM時(shí)對(duì)H9c2細(xì)胞沒(méi)有檢測(cè)到明顯的細(xì)胞毒性作用。
　　(2)濃度在0nM（TBHP作用組）、125nM、250nM、500nM的龍血素A和NAC，作用于TBHP損傷的H9c2細(xì)胞6、12、24小時(shí)，細(xì)胞存活率隨保護(hù)藥物（龍血素A和NAC）濃度的上升而增加。同等濃度(500nM)下，龍血素A抗氧化能力明顯強(qiáng)于NAC。
　　(3)根據(jù)以上龍血素A實(shí)驗(yàn)分組，TUNEL檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率

7、分別為49.8±2.1％、40.1±3.5％、29.7±2.4％、12.5±3.1％。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與TUNEL結(jié)果一致，細(xì)胞凋亡率分別為52±0.1％、31±0.5％、18±1.4％、10±1.1％。
　　(4)根據(jù)以上龍血素A實(shí)驗(yàn)分組，龍血素A具有明顯抑制TBHP誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞內(nèi)的MDA含量升高、SOD含量降低的作用。
　　(5)PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示龍血素A在500nM濃度時(shí)具有顯著

8、的抑制TBHP誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)Bax mRNA和Bax表達(dá)增高及Bcl-2 mRNA和Bcl-2表達(dá)的降低。
　　結(jié)論:
　　(1)龍血素A能夠顯著抑制TBHP誘導(dǎo)的H9c2大鼠心肌細(xì)胞凋亡。
　　(2)龍血素A可增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化酶SOD活性并且降低丙二醛(MDA)含量。
　　(3)在TBHP誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷模型中，龍血素A在抗氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與調(diào)控Bcl-2家族蛋白有關(guān)，能夠顯著抑制細(xì)胞內(nèi)Bc