血紅素加氧酶-1介導姜黃素對抗H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的實驗研究.pdf

1、近年來,先天性心臟病的救治正向著復雜、危重和幼小化的方向發(fā)展,心肌缺血再灌注損傷已成為困擾臨床療效的重要問題。氧化應(yīng)激誘導的心肌細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激是指由于活性氧過量生成和/或細胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損,導致超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集,從而對細胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。大量研究表明,抑制氧化應(yīng)激誘導的心肌細胞凋

2、亡是減輕心肌缺血再灌注損傷的有效途徑。
　　血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶,能夠降解血紅素生成一氧化碳(carbon monoxide,CO)、Fe2+和膽紅素(bilirubin)。研究表明,在多種心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭的研究中,采用藥理學方法或基因方法使HO-1蛋白表達增加可抑制心肌細胞損傷。姜黃素是從姜科植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素,

3、具有抑制腫瘤、抗炎以及抗氧化等多種生物學效應(yīng)。已有研究證實,在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞和成纖維細胞中,姜黃素能夠成濃度依賴性的誘導HO-1蛋白表達及活性增加,進而發(fā)揮細胞保護作用。因此,我們推測姜黃素可能對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷具有保護效應(yīng),且該效應(yīng)與HO-1密切相關(guān)。
　　Akt(protein kinase B,PKB,又稱Akt)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)的下游

4、信號調(diào)節(jié)激酶之一,在多種物質(zhì)介導的抗凋亡效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在多種細胞損傷模型中,PI3K/Akt信號通路介導的HO-1蛋白上調(diào)能夠使細胞對抗多種應(yīng)激刺激。核因子NF-κB是一個多效能的核轉(zhuǎn)錄因子,在不同的細胞模型中可表現(xiàn)為凋亡抑制或凋亡促進作用。
　　本實驗旨在通過建立H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型,在細胞水平上探討姜黃素的心血管保護作用以及HO-1介導姜黃素對抗H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的機制。
　　第

5、一部分HO-1對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用研究
　　目的:探討HO-1對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用及其機制。
　　方法:建立H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型,給予HO-1誘導劑hemin預處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育。雙波長法檢測HO-1活性;四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞存活率;Hoechst33342染色和caspase-3活性檢測評估細胞凋亡;硫代巴比妥酸顯色

6、法檢測MDA含量,氮藍四唑顯色法檢測總SOD活性;western blot法檢測NF-κB蛋白表達水平。
　　結(jié)果與對照組相比,hemin成濃度依賴性的誘導HO-1活性增加。與H2O2組相比,HO-1活性增加能夠顯著下調(diào)細胞凋亡率和caspase-3活性,降低細胞MDA含量,增加總SOD活性,且上述作用能被Znpp-IX逆轉(zhuǎn)。此外,HO-1活性增加能夠顯著抑制H2O2誘導的NF-κB激活,且該作用能被Znpp-IX逆轉(zhuǎn)。
　

7、　結(jié)論:Hemin誘導的HO-1活性增加可能通過抑制NF-κB激活,維持細胞氧化還原平衡狀態(tài),抑制H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分HO-1介導姜黃素對抗H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷
　　目的:探討姜黃素對H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的保護效應(yīng)以及HO-1在該效應(yīng)中的作用。
　　方法:建立H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型,給予姜黃素預處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育。

8、雙波長法檢測HO-1活性;MTT法檢測細胞存活率;流式細胞術(shù)Annexin-V FITC/PI染色和caspase-3活性檢測評估細胞凋亡;硫代巴比妥酸顯色法檢測MDA含量,氮藍四唑顯色法檢測總SOD活性。western blot檢測HO-1,Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3蛋白表達水平。
　　結(jié)果:與對照組相比,姜黃素呈濃度依賴性的上調(diào)HO-1 mRNA表達,同時上調(diào)HO-1蛋白表達和活性。與H2O2組相比

9、,姜黃素能夠顯著上調(diào)細胞存活率,下調(diào)細胞凋亡率和caspase-3活性。同時,姜黃素能夠顯著抑制H2O2誘導的bcl-2/bax比例下降以及cleaved caspase-3蛋白表達增加。此外,姜黃素能夠顯著抑制H2O2誘導的細胞MDA含量增加以及總SOD活性下降。姜黃素的上述作用均能被Znpp-IX部分逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:姜黃素可能通過增加HO-1蛋白表達,上調(diào)HO-1活性,維持細胞氧化還原平衡狀態(tài),對抗H2O2誘導的H9c2心肌

10、細胞氧化應(yīng)激損傷。
　　第三部分HO-1介導姜黃素對抗H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的機制研究
　　目的:探討HO-1介導姜黃素對抗H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷的機制。
　　方法:5-15μM姜黃素處理H9c2心肌細胞12h或15μM姜黃素處理H9c2心肌細胞0.5-12h,western blot檢測p-Akt,t-Akt蛋白表達水平。建立H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型:(1)給予姜黃素預處理,或給予P

11、I3K抑制劑LY294002共孵育,western blot法檢測cleaved caspase-3和HO-1蛋白表達水平。(2)給予姜黃素預處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育,western blot法檢測核因子NF-κB蛋白表達水平。
　　結(jié)果:5-15μM姜黃素可成濃度依賴性的誘導p-Akt/t-Akt比例增加,15μM姜黃素處理H9c2心肌細胞0.5-12h后,p-Akt/t-Akt比例在30min內(nèi)顯著上升,

12、隨后逐漸下降。在H2O2誘導的H9c2心肌細胞氧化應(yīng)激損傷模型中,姜黃素對cleaved caspase-3蛋白表達的抑制效應(yīng)能夠被PI3K抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)。同時,LY294002能夠顯著抑制姜黃素誘導的HO-1蛋白表達水平上調(diào)。此外,姜黃素預處理能夠顯著抑制H2O2誘導的NF-κB激活,且該作用能被Znpp-IX部分逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:姜黃素可能通過PI3K/Akt信號途徑上調(diào)HO-1蛋白表達,抑制H2O2誘導的NF-κ