血紅素加氧酶-1介導(dǎo)姜黃素對(duì)抗H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來,先天性心臟病的救治正向著復(fù)雜、危重和幼小化的方向發(fā)展,心肌缺血再灌注損傷已成為困擾臨床療效的重要問題。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)。氧化應(yīng)激是指由于活性氧過量生成和/或細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損,導(dǎo)致超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等氧自由基及其相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集,從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性作用的病理狀態(tài)。大量研究表明,抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋

2、亡是減輕心肌缺血再灌注損傷的有效途徑。
　　血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是血紅素降解的起始酶和限速酶,能夠降解血紅素生成一氧化碳(carbon monoxide,CO)、Fe2+和膽紅素(bilirubin)。研究表明,在多種心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和心力衰竭的研究中,采用藥理學(xué)方法或基因方法使HO-1蛋白表達(dá)增加可抑制心肌細(xì)胞損傷。姜黃素是從姜科植物姜黃根莖中提取的一種酚性色素,

3、具有抑制腫瘤、抗炎以及抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)。已有研究證實(shí),在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中,姜黃素能夠成濃度依賴性的誘導(dǎo)HO-1蛋白表達(dá)及活性增加,進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。因此,我們推測(cè)姜黃素可能對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)效應(yīng),且該效應(yīng)與HO-1密切相關(guān)。
　　Akt(protein kinase B,PKB,又稱Akt)是磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)的下游

4、信號(hào)調(diào)節(jié)激酶之一,在多種物質(zhì)介導(dǎo)的抗凋亡效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在多種細(xì)胞損傷模型中,PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)的HO-1蛋白上調(diào)能夠使細(xì)胞對(duì)抗多種應(yīng)激刺激。核因子NF-κB是一個(gè)多效能的核轉(zhuǎn)錄因子,在不同的細(xì)胞模型中可表現(xiàn)為凋亡抑制或凋亡促進(jìn)作用。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,在細(xì)胞水平上探討姜黃素的心血管保護(hù)作用以及HO-1介導(dǎo)姜黃素對(duì)抗H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。
　　第

5、一部分HO-1對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究
　　目的:探討HO-1對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　方法:建立H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,給予HO-1誘導(dǎo)劑hemin預(yù)處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育。雙波長(zhǎng)法檢測(cè)HO-1活性;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率;Hoechst33342染色和caspase-3活性檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞凋亡;硫代巴比妥酸顯色

6、法檢測(cè)MDA含量,氮藍(lán)四唑顯色法檢測(cè)總SOD活性;western blot法檢測(cè)NF-κB蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果與對(duì)照組相比,hemin成濃度依賴性的誘導(dǎo)HO-1活性增加。與H2O2組相比,HO-1活性增加能夠顯著下調(diào)細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性,降低細(xì)胞MDA含量,增加總SOD活性,且上述作用能被Znpp-IX逆轉(zhuǎn)。此外,HO-1活性增加能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB激活,且該作用能被Znpp-IX逆轉(zhuǎn)。
　

7、　結(jié)論:Hemin誘導(dǎo)的HO-1活性增加可能通過抑制NF-κB激活,維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài),抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分HO-1介導(dǎo)姜黃素對(duì)抗H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷
　　目的:探討姜黃素對(duì)H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)以及HO-1在該效應(yīng)中的作用。
　　方法:建立H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,給予姜黃素預(yù)處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育。

8、雙波長(zhǎng)法檢測(cè)HO-1活性;MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率;流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V FITC/PI染色和caspase-3活性檢測(cè)評(píng)估細(xì)胞凋亡;硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)MDA含量,氮藍(lán)四唑顯色法檢測(cè)總SOD活性。western blot檢測(cè)HO-1,Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比,姜黃素呈濃度依賴性的上調(diào)HO-1 mRNA表達(dá),同時(shí)上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)和活性。與H2O2組相比

9、,姜黃素能夠顯著上調(diào)細(xì)胞存活率,下調(diào)細(xì)胞凋亡率和caspase-3活性。同時(shí),姜黃素能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的bcl-2/bax比例下降以及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加。此外,姜黃素能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞MDA含量增加以及總SOD活性下降。姜黃素的上述作用均能被Znpp-IX部分逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:姜黃素可能通過增加HO-1蛋白表達(dá),上調(diào)HO-1活性,維持細(xì)胞氧化還原平衡狀態(tài),對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌

10、細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。
　　第三部分HO-1介導(dǎo)姜黃素對(duì)抗H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究
　　目的:探討HO-1介導(dǎo)姜黃素對(duì)抗H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制。
　　方法:5-15μM姜黃素處理H9c2心肌細(xì)胞12h或15μM姜黃素處理H9c2心肌細(xì)胞0.5-12h,western blot檢測(cè)p-Akt,t-Akt蛋白表達(dá)水平。建立H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型:(1)給予姜黃素預(yù)處理,或給予P

11、I3K抑制劑LY294002共孵育,western blot法檢測(cè)cleaved caspase-3和HO-1蛋白表達(dá)水平。(2)給予姜黃素預(yù)處理,或給予HO-1抑制劑Znpp-IX共孵育,western blot法檢測(cè)核因子NF-κB蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:5-15μM姜黃素可成濃度依賴性的誘導(dǎo)p-Akt/t-Akt比例增加,15μM姜黃素處理H9c2心肌細(xì)胞0.5-12h后,p-Akt/t-Akt比例在30min內(nèi)顯著上升,

12、隨后逐漸下降。在H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中,姜黃素對(duì)cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)能夠被PI3K抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)。同時(shí),LY294002能夠顯著抑制姜黃素誘導(dǎo)的HO-1蛋白表達(dá)水平上調(diào)。此外,姜黃素預(yù)處理能夠顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κB激活,且該作用能被Znpp-IX部分逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:姜黃素可能通過PI3K/Akt信號(hào)途徑上調(diào)HO-1蛋白表達(dá),抑制H2O2誘導(dǎo)的NF-κ