血紅素加氧酶-1在糖尿病氧化應(yīng)激中的作用研究.pdf

1、糖尿病在全球尤其是發(fā)展中國(guó)家的患病人數(shù)急劇增加，已成為嚴(yán)重危害人類健康的流行性疾病。由于糖尿病慢性并發(fā)癥可引起失明、尿毒癥、截肢等嚴(yán)重后果，已成為目前全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，也是目前的防治重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前對(duì)HO-1在糖尿病氧化應(yīng)激中的作用及其機(jī)制尚未完全闡明，本課題擬從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)兩方面對(duì)HO-1在拮抗糖尿病氧化應(yīng)激中的作用進(jìn)行探討，為尋求有效的拮抗糖尿病氧化應(yīng)激的手段提供科學(xué)的依據(jù)。 第一章、 HO-1在高糖和AGEs致T

2、HP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)變化研究 目的： 1．探討不同濃度葡萄糖、晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）在不同刺激時(shí)間對(duì)THP-1細(xì)胞ROS產(chǎn)量的影響； 2．了解高糖和AGEs聯(lián)合刺激對(duì)THP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響； 3．了解HO-1在高糖和AGEs所致THP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激中的表達(dá)變化； 4．探討p38MAPK信號(hào)通路是否參與了高糖和AGEs誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞HO-1表達(dá)。 方法：

3、1．細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)人單核細(xì)胞株THP-1。 2．體外制備AGEs：將牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與葡萄糖混合于37℃孵育60天，4℃透析24h以去除未結(jié)合的葡萄糖。 3．細(xì)胞ROS產(chǎn)量檢測(cè)：分別用5、15、25mmol/L的GLU或25、50、100μg/mL的AGEs刺激細(xì)胞，分別于刺激0．5、2、6、24

4、h后收集細(xì)胞，DCFH-DA熒光探針標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）。 4．細(xì)胞分組：分為4組，即15mmol/LGLU組（高糖組）、100μg/mLAGEs組（AGEs組）、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs組（高糖+AGEs聯(lián)合組）及對(duì)照組。 5．細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNFa水平檢測(cè)：采用ELISA方法進(jìn)行。 6．細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MDA

5、水平檢測(cè)：采用硫代巴比妥酸法（thiobarbituric acid，TBA），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明步驟檢測(cè)。 7．RT-PCR法檢測(cè)HO-1mRNA表達(dá)：提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），兩步法進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物于1．5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。 8．免疫印記（western blot，WB）法檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)：提取總蛋白，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl

6、sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter，NC）封閉非特異位點(diǎn)。利用多克隆兔抗人HO-1抗體及HRP標(biāo)記的二抗與NC反應(yīng)，DAB顯色后拍照分析條帶亮度。 9．SB203580（SB，p38MAPK抑制劑）干預(yù)實(shí)驗(yàn)：分為高糖組、SB+15mmol/LGLU（SB+高糖）組、AGEs組、SB+100μg/

7、mLAGEs（SB+AGEs）組。10μmo/LSB干預(yù)30min后換以含15mmol/LGLU或100μg/mL AGEs細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育24h，收集細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)HO-1mRNA表達(dá)水平。 10．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13．0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設(shè)計(jì)的方差分析（ANOVA），任意兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用積矩相關(guān)系數(shù)（P

8、earson相關(guān)系數(shù)）分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0．05。 結(jié)論： 1．高糖和AGEs單獨(dú)刺激能導(dǎo)致THP-1細(xì)胞氧化損傷加劇、分泌炎癥因子TNFα水平及HO-1表達(dá)增高，二者聯(lián)合刺激能使上述改變進(jìn)一步加劇。 2．p38MAPK抑制劑對(duì)高糖和AGEs誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞HO-1mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響。 3．HO-1表達(dá)與細(xì)胞氧化損傷及炎癥指標(biāo)呈顯著正相關(guān)，提示高糖和AGEs導(dǎo)致THP-1細(xì)胞氧化損傷及炎癥反應(yīng)，

9、后者誘導(dǎo)HO-1表達(dá)適應(yīng)性和代償性增高，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。 第二章、抑制HO-1對(duì)高糖和AGEs致THP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 目的： 探討抑制HO-1表達(dá)對(duì)高糖和AGEs刺激下THP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。 方法： 1．細(xì)胞分組：分為4組，即對(duì)照組、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs）組、ZnPP組及ZnPP+15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（

10、ZnPP+GLU+AGEs）組，其中對(duì)照組和ZnPP組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液的GLU濃度均為5mmol/L。 2．細(xì)胞ROS產(chǎn)量、細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)同第一章。 3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13．0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設(shè)計(jì)的方差分析（ANOVA），任意兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0

11、．05。 結(jié)論： HO-1抑制劑ZnPP本身也能對(duì)THP-1細(xì)胞造成一定的氧化損傷，并引起HO-1表達(dá)增高，ZnPP預(yù)處理能顯著抑制高糖和AGEs引起的HO-1表達(dá)增高，進(jìn)一步加劇高糖和AGEs引起的細(xì)胞氧化損傷及分泌炎癥因子TNFa的水平。 第三章、誘導(dǎo)HO-1對(duì)高糖和AGEs致THP-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 目的： 探討誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)是否可對(duì)抗高糖和AGEs所致THP-1細(xì)胞的氧化損傷。

12、 方法： 1．細(xì)胞分組：分為4組，即對(duì)照組、15mmol/LGLU+100μg/mLAGEs（GLU+AGEs組）、CoPP組、CoPP+15mmol/LGLU+100μg/mL AGEs（CoPP+GLU+AGEs組），其中對(duì)照組和CoPP組THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液的GLU濃度均為5mmol/L。 2．細(xì)胞ROS產(chǎn)量、細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MDA及TNFa水平、HO-1mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)同第一章。 3．統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)處理：用SPSS13．0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間資料比較用析因設(shè)計(jì)的方差分析（ANOVA），各組內(nèi)均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或單向方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用LSD法（Least-significant difference test）。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0．05。 結(jié)論： 在高糖和AGEs存在的情況下，HO-1誘導(dǎo)劑CoPP誘導(dǎo)HO-1蛋

14、白表達(dá)增加，并顯著抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，明顯減輕高糖和AGEs所致氧化損傷，而CoPP本身并不引起THP-1細(xì)胞氧化損傷和分泌炎癥因子水平增加，結(jié)果提示誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)可能是極具潛力的新的糖尿病慢性并發(fā)癥的治療靶點(diǎn)之 第四章、2型糖尿病合并慢性并發(fā)癥患者的外周血單核細(xì)胞HO-1表達(dá)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究 目的： 1．了解初診2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）合并慢性并發(fā)癥患者外周

15、血單核細(xì)胞HO-1的表達(dá)情況； 2．探討初診T2DM合并慢性并發(fā)癥患者外周血單核細(xì)胞HO-1表達(dá)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性。 方法： 1．樣本選擇：來(lái)自我院內(nèi)分泌代謝科門(mén)診及住院的初次診斷T2DM的患者36例，健康志愿者10例。分為正常對(duì)照組、糖尿病無(wú)并發(fā)癥組和糖尿病并發(fā)癥組。 2．細(xì)胞收集：采集清晨空腹靜脈抗凝血，Percoll法分離單核細(xì)胞。 3．細(xì)胞ROS產(chǎn)量、血清MDA水平及HO-1mRNA表達(dá)檢

16、測(cè)同第一章。 4．HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用免疫熒光法檢測(cè)，將外周血單核細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色后，在熒光顯微鏡下觀察HO-1在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13．0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間資料比較用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用積矩相關(guān)系數(shù)（Pearson相關(guān)系數(shù)）分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0．05。 結(jié)論： 1．初診T2DM患者的血糖、血

17、清MDA、外周血單核細(xì)胞ROS產(chǎn)量及HO-1表達(dá)均顯著高于正常對(duì)照組，提示初診T2DM可能由于機(jī)體抗氧化防御機(jī)制的代償性增高仍不足以對(duì)抗高血糖引起的氧化損傷，導(dǎo)致機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。 2．并發(fā)癥組的血糖水平、氧化應(yīng)激指標(biāo)及HO-1表達(dá)均顯著高于無(wú)并發(fā)癥組，提示高血糖及其引起的氧化損傷可能參與了初診T2DM患者慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，在排除BMI及血糖水平等因素的影響后，氧化應(yīng)激指標(biāo)仍與HO-1表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示HO-1作為一