血紅素加氧酶-1在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)機制研究.pdf

1、背景:血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1)，又稱熱休克蛋白32 (Heat-shock protein32)，相對分子量為32 kDa。基因名稱為HO-1，位于人類常染色體22q13。HO-1是降解血紅素重要的限速酶，控制著亞鐵(Fe2+)的代謝。以往對HO-1的研究主要是其對心血管疾病方面的作用，表現(xiàn)為HO-1對于保持細胞穩(wěn)態(tài)、減低組織氧化損傷、削弱炎性反應(yīng)、抑制細胞凋亡方面有著重要作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)HO-1與

2、腫瘤細胞增殖、血管發(fā)生、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)，增高HO-1的表達可促進腫瘤轉(zhuǎn)移擴散，經(jīng)HO-1 SiRNA(HO-1 small interference RNA)轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞其增殖、轉(zhuǎn)移能力降低[2]，并且HO-1蛋白在眾多惡性腫瘤或惡性腫瘤細胞中的表達上調(diào)，尤其是在高度惡性腫瘤或者轉(zhuǎn)移腫瘤中表達上調(diào)更加明顯，因此HO-1蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密不可分。現(xiàn)有研究表明過表達的HO-1蛋白可促進人胃癌細胞的瘤形成及癌細胞增殖，并且胃癌

3、的發(fā)生與凋亡因子P21啟動有關(guān)[3]。但有關(guān)HO-1蛋白在人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的作用及其機制目前尚不明確。本課題組在前期的工作中建立了胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞株--GC9811-P[4]，該細胞株生長力旺盛、增殖較快，裸鼠成瘤率高，潛伏期短，種植裸鼠腹腔后腹膜轉(zhuǎn)移率高(100[％])，能較好地模擬自由癌細胞脫落人腹腔后著床、粘附、侵襲生長以及腫瘤周圍血管生成等病理步驟。進一步通過Western blot免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)GC9811-P細胞株與其

4、母系胃癌細胞株GC9811相比，其表達HO-1蛋白的能力顯著增強，初步推測HO-1蛋白在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。
　　 目的:
　　 1、明確HO-1蛋白在人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達，比較HO-1蛋白在癌組織與正常組織表達的差異，探究HO-1蛋白與人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者病理參數(shù)之間的關(guān)系。
　　 2、應(yīng)用HO-1蛋白抑制劑抑制胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞株HO-1蛋白的表達，通過比較高、低表達HO-1蛋白的細胞株的增殖

5、、凋亡、血管發(fā)生等生物學(xué)行為的變化，來闡明HO-1蛋白在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程的作用及可能機制。
　　 方法:
　　 1、免疫組化SP法檢測68例胃腺癌腹膜轉(zhuǎn)移組織及其癌旁腹膜組織HO-1蛋白的表達，以及46例無腹膜轉(zhuǎn)移胃腺癌組織HO-1蛋白的表達，Western蛋白印跡法檢測14例胃腺癌腹膜轉(zhuǎn)移術(shù)后組織與癌旁腹膜組織HO-1蛋白的表達，以及GC9811-P細胞株與GC9811、GC7901細胞株HO-1蛋白的表達。
　

6、　 2、MTT法測定與1×10-4、1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9 mol/LHO-1蛋白抑制劑共孵育48 h人胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞的增殖性；流式細胞術(shù)檢測低表達HO-1蛋白的胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞的細胞周期和凋亡指數(shù)；Western blot免疫印跡法測定與抑制劑共孵育后，胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平。
　　 3、雞胚尿囊膜試驗觀察與抑制劑共孵育后，胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移

7、細胞在雞胚尿囊膜表面的新生血管數(shù)目與血管分支點數(shù)目，評價抑制HO-1蛋白表達其血管發(fā)生作用的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫組織化學(xué)染色法研究結(jié)果表明，HO-1蛋白在胃癌腹膜組織中的陽性表達率為41.2[％]，在轉(zhuǎn)移癌旁腹膜組織中的陽性表達率為0，而在無腹膜轉(zhuǎn)移胃腺癌組織中的陽性表達率為21.7[％]；HO-1蛋白在人胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織紅的陽性表達率顯著高于癌旁腹膜組織(P<0.01)及無腹膜轉(zhuǎn)移胃腺癌組織(P<0.0

8、5)，HO-1蛋白在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織中的表達顯著增強。
　　 2、免疫組織化學(xué)染色法研究表明，HO-1蛋白在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移組織的表達強度與患者年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而與轉(zhuǎn)移癌組織分化有關(guān)：低分化轉(zhuǎn)移癌組織HO-1蛋白表達強度顯著高于中等分化轉(zhuǎn)移癌組織(P<0.05)，中等分化轉(zhuǎn)移癌組織HO-1蛋白的表達強度顯著高于高分化轉(zhuǎn)移癌組織(P<0.05)。
　　 3、Western blot印跡法表明，HO-1蛋白在人胃癌腹

9、膜轉(zhuǎn)移術(shù)后組織標本中表達水平顯著高于其癌旁腹膜組織的表達(P<0.05)，HO-1蛋白在胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞中的表達顯著高于GC9811細胞及GC7901細胞中的表達，進一步驗證了HO-1蛋白在轉(zhuǎn)移癌組織及細胞株中的高表達。
　　 4、HO-1蛋白抑制劑和胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞共孵育后，應(yīng)用MTT法測定細胞增殖，顯示胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞HO-1蛋白表達受抑制后其增殖力降低，當(dāng)抑制劑濃度為1×10-4mol/L時，細胞增殖抑制率達(62.

10、04±6.13)[％]，IC50為1.2×10-5mol/L，說明HO-1蛋白在胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞的增殖過程中可能起重要作用。
　　 5、HO-1蛋白抑制劑與胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞共孵育后，流式細胞術(shù)檢測胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞的凋亡指數(shù)及細胞周期，顯示低表達HO-1蛋白的胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞其凋亡指數(shù)增加，48 h凋亡指數(shù)達(61.1±5.8)[％]，細胞阻滯在G1與S期，48 h 細胞(G1、S)期占(88.23±6.7)[％]；Wes

11、tern免疫印跡法顯示低表達HO-1蛋白的胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞伴隨Bcl-2及Bax蛋白表達水平的下降，說明HO-1蛋白參與胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞的凋亡作用，并且該凋亡作用與細胞周期G1、 S期阻滯有關(guān)。
　　 6、雞胚尿囊膜試驗(CAMs)：HO-1蛋白抑制劑與含2×106GC9811-P細胞的培養(yǎng)血清在雞胚尿囊膜表面共培養(yǎng)4-5d后，雞胚新生血管與血管分支點數(shù)數(shù)目顯著減少(P<0.05)，低表達HO-1蛋白的胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細胞血管