WDR26對(duì)氧化應(yīng)激所致心肌細(xì)胞mPTP開放的影響及其心肌保護(hù)作用研究.pdf

1、在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后，心肌組織損傷反而加重的現(xiàn)象稱為心肌缺血-再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）。心肌缺血再-灌注損傷常見于冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、心血管栓塞再通、體外循環(huán)下行心肺直視手術(shù)等。其發(fā)生機(jī)制與活性氧的產(chǎn)生、鈣超載、微血管損傷和能量代謝障礙等有關(guān)。過氧化氫，超氧陰離子和羥自由基等活性氧在心肌缺血-再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用。
　　 WD重復(fù)序列是一段包括

2、在甘氨酸-組氨酸(GH)二肽和色氨酸-天門冬氨酸(WD)二肽之間的含有40個(gè)左右氨基酸的保守氨基酸片段。這些重復(fù)序列可以形成的蛋白結(jié)構(gòu)域被稱為WD區(qū)域。WDR蛋白家族是包含4～16個(gè)WD重復(fù)序列的廣泛存在于真核生物的一組蛋白。WDR蛋白有著廣泛的功能。這些功能包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期控制、自噬與細(xì)胞凋亡等，主要通過形成多蛋白復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)，而且與許多疾病具有密切關(guān)系。WDR26(WD repeatdomain26)基因是本實(shí)驗(yàn)

3、室研究人員采用生物信息學(xué)技術(shù)和5’-RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，從大鼠心肌組織中首次克隆的一個(gè)在缺血預(yù)適應(yīng)中表達(dá)上調(diào)的新基因，最初命名為Mipu2(myocardialischemic preconditioning upregulated protein2)。作為一個(gè)在心肌缺血預(yù)適應(yīng)中表達(dá)升高的蛋白，是否對(duì)心肌缺血-再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，目前尚不清楚。
　　 為了觀察WDR26的表達(dá)模式，本實(shí)驗(yàn)分別采用大鼠心肌缺血-再灌損傷和

4、H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。利用real-time PCR和Western-blot分別檢測(cè)WDR26的mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌缺血-再灌注損傷中WDR26的mRNA和蛋白水平在缺血再灌注lh和2h后明顯增高。H9c2細(xì)胞暴露于過氧化氫后，WDR26的mRNA和蛋白水平在2h和4h后明顯增高。以上結(jié)果表明:心肌缺血-再灌損傷和心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷可以使WDR26表達(dá)增高。
　　 隨后利用Westem-blot和激光

5、共聚焦顯微鏡檢測(cè)了WDR26的亞細(xì)胞定位。Western-blot結(jié)果顯示W(wǎng)DR26蛋白在線粒體中表達(dá)。H9c2心肌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染W(wǎng)DR26基因后，利用線粒體標(biāo)記探針Mito-tracker標(biāo)記線粒體，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)WDR26和線粒體標(biāo)記存在共定位。這些結(jié)果表明，WDR26蛋白定位于線粒體。
　　 為進(jìn)一步探討WDR26對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，采用WDR26過表達(dá)和表達(dá)抑制策略觀察了WDR26對(duì)過氧化氫所致H9c2心

6、肌細(xì)胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WDR26過表達(dá)可明顯抑制過氧化氫引起的心肌細(xì)胞壞死和凋亡，WDR26抑制表達(dá)后可加重這種損傷作用。此外WDR26過表達(dá)可明顯抑制過氧化氫引起的Caspase-3和Caspase9活性增加，并且可抑制細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿。以上結(jié)果表明: WDR26可抑制過氧化氫引起的心肌細(xì)胞壞死和凋亡，其抗凋亡作用可能主要通過抑制線粒體凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 由于WDR蛋白主要通過和其它蛋白相互作用來(lái)發(fā)揮其功

7、能，本研究采用免疫沉淀和蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析對(duì)WDR26相互作用蛋白進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有47個(gè)蛋白可能與WDR26相互作用。前文證實(shí)WDR26能抵抗過氧化氫所致的心肌細(xì)胞凋亡，但機(jī)制不明。鑒于線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)的開放在細(xì)胞凋亡發(fā)生中的作用，本研究采用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步探討WDR26與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的MPTP——蛋白電位依賴性陰離子選擇性通道(

8、voltage-dependent anion channel protein，VDAC)和腺苷酸轉(zhuǎn)位子(adenine nucleotide translocator，ANT)的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WDR26與電VDAC和ANT具有相互作用。
　　 為進(jìn)一步研究WDR26對(duì)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放的影響，本研究采用WDR26過表達(dá)的H9c2心肌細(xì)胞，經(jīng)過氧化氫處理后觀察細(xì)胞線粒體膜電位的變化，并分離上述細(xì)胞的線粒體，經(jīng)鈣離子刺

9、激后檢測(cè)線粒體的腫脹。結(jié)果表明WDR26過表達(dá)可以明顯抑制過氧化氫引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降和鈣離子引起的線粒體腫脹。
　　 綜上所述，WDR26作為一個(gè)在心肌中新發(fā)現(xiàn)的蛋白，對(duì)心肌缺血-再灌注損傷和心肌氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮重要的保護(hù)作用。心肌缺血-再灌損傷及氧化應(yīng)激損傷中WDR26的表達(dá)明顯增加。WDR26通過與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔蛋白VDAC和ANT發(fā)生相互作用，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放和線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，從