缺氧預(yù)適應(yīng)通過Nrf2通路上調(diào)抗氧化酶介導(dǎo)心肌細(xì)胞延遲保護(hù)的實驗研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建靶向Nrf2基因的siRNA真核表達(dá)重組載體,轉(zhuǎn)染H9c2心肌樣細(xì)胞,利用缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型及缺氧預(yù)適應(yīng)(HPC)延遲保護(hù)模型,從Nrf2-ARE信號通路的角度,探討 HPC上調(diào)抗氧化酶(HO-1、MnSOD)介導(dǎo)心肌細(xì)胞延遲保護(hù)的新途徑。
　　方法:
　　1.利用siRNA真核表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo,設(shè)計并構(gòu)建靶向Nrf2的RNA干擾重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2

2、siRNA,同時設(shè)計并構(gòu)建陰性對照RNA干擾重組載體,用于鑒定pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾體系的特異性;
　　2.通過Western Blot法分別檢測H9c2心肌樣細(xì)胞經(jīng)HPC處理后0、12、24、48、72 h各時間點(diǎn)的Nrf2核轉(zhuǎn)位變化;并在Nrf2核轉(zhuǎn)位最顯著的時間點(diǎn),應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)法檢測胞核內(nèi)Nrf2與HO-1及MnSOD基因啟動子區(qū)內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合的變化;
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3、. H9c2細(xì)胞經(jīng) pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重組載體或陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,建立HPC延遲保護(hù)模型。實驗處理后,通過Western Blot法分別檢測核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)以及胞內(nèi)HO-1、MnSOD蛋白表達(dá)的變化;
　　4. H9c2細(xì)胞經(jīng) pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA重組載體或陰性對照載體pGPU6/GFP/Neo-NC siRNA

4、瞬時轉(zhuǎn)染24 h后,分別建立H/R損傷及HPC延遲保護(hù)模型。實驗處理后,MTT法檢測各實驗組心肌細(xì)胞存活率;根據(jù)試劑盒說明分別檢測各組細(xì)胞內(nèi)LDH的漏出量,應(yīng)用比色法測定MDA含量以及SOD、CAT、GPx等抗氧化物酶的活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的變化。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)基因測序證實,成功構(gòu)建了 Nrf2 siRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA及陰性對照載體pGP

5、U6/GFP/Neo-NC siRNA。此外,經(jīng)Western blot檢測證實該質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞24 h后,胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　2. H9c2心肌樣細(xì)胞經(jīng)HPC處理后12 h,Nrf2核轉(zhuǎn)位開始增加,HPC后24 h達(dá)到峰值,而HPC后72 h回到基礎(chǔ)水平。可見,HPC誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位變化與HPC延遲保護(hù)出現(xiàn)的時間窗相一致;同時,ChIP法證實HPC后24 h,Nrf2在胞核內(nèi)與HO-1及MnSOD基因

6、啟動子區(qū)內(nèi)ARE的結(jié)合均明顯增加。
　　3. H9c2心肌樣細(xì)胞經(jīng)HPC處理后24 h,核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)及胞內(nèi)抗氧化酶HO-1、MnSOD的蛋白表達(dá)水平顯著增加,與相應(yīng)的Control組比較均有顯著性差異(p<0.01)。然而,預(yù)先瞬時轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA表達(dá)載體后,HPC上述效應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。
　　4. H9c2心肌樣細(xì)胞經(jīng)HPC處理后24 h,可顯著提高H/R損傷心肌細(xì)胞的生存率,抑制LDH的活性;并能顯著減少H9c2

7、心肌細(xì)胞H/R過程中所產(chǎn)生的活性氧,同時增加內(nèi)源性抗氧化酶(SOD,GPx,CAT)活性,并減少M(fèi)DA的生成,在細(xì)胞水平上進(jìn)一步證明了HPC能對抗H/R所誘發(fā)的氧化應(yīng)激,產(chǎn)生延遲保護(hù)作用。然而,預(yù)先瞬時轉(zhuǎn)染Nrf2 siRNA表達(dá)載體后,HPC上述效應(yīng)均被逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了Nrf2 siRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-Nrf2 siRNA,為進(jìn)一步研究Nrf2信號通路在HPC心肌延遲保護(hù)