黃芪調控內源性保護機制減輕缺氧心肌細胞氧化損傷的研究.pdf

1、我們以往的研究表明，嚴重燒傷后早期(在因毛細血管通透性增加導致有效循環(huán)血容量顯著減少之前)即出現(xiàn)的心肌損害及心臟泵血功能減弱，不僅引起心功能不全，還可誘發(fā)或加重休克，成為燒傷早期缺血缺氧的重要啟動因素之一。根據(jù)這一認識，提出了燒傷早期缺血缺氧損害的“休克心”假說。因此，防治燒傷后“休克心”對減輕嚴重燒傷早期缺血缺氧損害具有重要臨床意義，但目前尚缺乏有效措施。缺血缺氧時心肌細胞內活性氧(ROS)蓄積所致的氧化損傷是心肌損傷的重要原因。清除

2、ROS可以有效減輕心肌細胞損傷，是防治缺血缺氧心肌損害的一個重要方向。 黃芪的主要化學成分有皂甙、黃酮、多糖、微量元素，以及氨基酸、亞油酸等。它對缺血缺氧心肌具有保護作用，作用機制不甚清楚，限制了對它的深入研究和推廣應用。黃芪甲苷是一種從黃芪中提取的皂甙類化合物，《中國藥典》中以其作為判斷黃芪及其制品，如黃芪口服液的質量標準。槲皮素是黃芪黃酮類化合物中含量較高的一種。這兩種單體清除ROS，減輕其他疾病導致的心肌氧化損傷的作用均已

3、見報道，但對燒傷早期缺氧心肌細胞氧化損傷的保護作用，以及是否通過調控內源性保護機制減輕缺氧心肌細胞氧化損傷，還缺乏研究。 一、研究目的： 本研究選取這兩種具有代表性的黃芪單體，旨在觀察比較它們對缺氧心肌細胞氧化損傷的作用并確定其量效關系；選擇效果較好的一種單體和劑量，深入探討其除ROS的機制，明確黃芪甲苷是否通過調控內源性抗氧化機制減輕缺氧心肌細胞氧化損傷，為臨床防治燒傷后“休克心”提供新的思路和實驗依據(jù)。 二、

4、材料方法： 1．分離培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞，在94％N2、5％CO<,2>、1％O<,2>的混合氣體中培養(yǎng)，制作缺氧模型，缺氧時間為12h。 2．將細胞隨機分為常氧組(A組)、單純缺氧組(B組)、缺氧+槲皮素組(C組，C<,1>組100 mg/L、C<,2>組50 mg/L、C<,3>組25 mg/L)、缺氧+黃芪甲苷組(D組，D<,1>組．50mg/L、D<,2>組25 mg/L、D<,3>組12.5 mg/L)，缺氧+

5、維生素E組(E組10 mg/L)。槲皮素、黃芪甲苷濃度根據(jù)已有文獻和預實驗確定。 3．每組設3個復孔，重復3次，檢測常氧、缺氧和缺氧條件下黃芪單體作用前后各組心肌細胞活力(CCK-8)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)的含量；根據(jù)檢測結果，槲皮素、黃芪甲苷組分別選擇一種劑量，檢測其作用前后缺氧細胞內ROS濃度的變化。 4．根據(jù)以上實驗結果，挑選黃芪甲苷(25mg/L)進一步研究

6、其清除ROS的機制。 5．利用化合反應使FITC或HRP與黃芪甲苷分子連接，以達到標記和示蹤黃芪甲苷分子的目的。在熒光倒置顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或透射電子顯微鏡下觀察標記后的黃芪甲苷分子入胞和胞內分布情況。 6．試劑盒檢測黃芪甲苷在體外自由基生成體系中清除羥自由基(OH<'->)、超氧陰離子(O<,2><'->)的能力。 7．用SOD阻斷劑DDC阻斷內源性SOD活性后，檢測黃芪甲苷清除缺氧心肌細胞內ROS的能力

7、的變化情況。 8．采用逆轉錄一聚合酶聯(lián)反應(RT-PCR)法檢測常氧和缺氧(缺氧時間為12h或3h)情況下黃芪甲苷作用前后心肌細胞SOD-1 mRNA表達量的變化。 9．采用免疫蛋白質印跡(Western blotting)法檢測常氧和缺氧(缺氧時間為12h)情況下黃芪甲苷作用前后心肌細胞SOD-1蛋白表達量的變化。 10．所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，實驗結果采用SPSS 11.0統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析On

8、e-Way ANOVA或均值t檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為非常顯著。 三、主要結果： 1．單純缺氧組培養(yǎng)液中LDH、MDA濃度和細胞中的ROS濃度較常氧組明顯升高，細胞活力、SOD活性下降。缺氧+槲皮素(25～100 mg/L)組、缺氧+黃芪甲苷(12.5～50mg/L)組、缺氧+維生素E(10mg/L)組培養(yǎng)液中LDH、MDA濃度和細胞中ROS濃度較單純缺氧組下降，細胞活力、SOD活性回升。黃芪甲苷、槲

9、皮素的中劑量和大劑量組(C<,1-2>、D<,1-2>)改善各個指標的作用均優(yōu)于黃芪甲苷、槲皮素低劑量組(C<,3>、D<,3>)和維生素E(10mg/L)組。同等劑量(C<,1>與D<,1>，C<,2>與D<,2>)相比，黃芪甲苷組降低LDH濃度和提高細胞活力的作用優(yōu)于槲皮素組，但二者降低MDA、ROS濃度、提高SOD活性的作用無顯著差異。 2．合成并提純了黃芪甲苷-BSA-FITC和黃芪甲苷-BSA-HRP化合物。分別在49

10、5nm(FITC在此處有特征吸收率)、403nm(HRP在此處有特征吸收率)處測吸光度，根據(jù)標準曲線確定化合物中FITC、HRP濃度，結果如下：FITC：7.2mg/L，HRP：44mg/L。 3．熒光倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察黃芪甲苷-BSA-FITC胞內分布情況，可見心肌細胞胞漿中有彌散的綠色熒光，分布不均，胞核中無熒光分布；透射電鏡下觀察黃芪甲苷-BSA-HRP分布情況，可見高電子密度的黑褐色粗大顆粒分布于線粒體膜

11、上，其余細胞器和陰性對照細胞未見高電子密度顆粒分布。 4．體外自由基生成體系中，黃芪甲苷在12.5-100 mg/L濃度范圍內對OH<'->具有顯著清除能力，且隨劑量升高清除能力增強；黃芪甲苷對O<,2><'->無顯著清除能力。 5．黃芪甲苷(25mg/L)能顯著降低缺氧后心肌細胞內ROS濃度；SOD阻斷劑DDC(50uM)作用后，黃芪甲苷清除ROS的效應基本消失。 6．常氧和缺氧(缺氧時間為12h或3h)條件下

12、黃芪甲苷處理后心肌細胞SOD-1mRNA表達量較前均有所增高。缺氧12h和缺氧3h變化趨勢一致。 7．常氧和缺氧(缺氧時間為12h)條件下黃芪甲苷處理后心肌細胞SOD-1蛋白量表達較前均有增高。 四、討論與結論： 1．槲皮素(25～100 mg/L)、黃芪甲苷(12.5～50 mg/L)能有效清除細胞內ROS、提高SOD活性、減輕細胞氧化損傷、提高細胞活力。其中大、中劑量的槲皮素(50、100mg/L)和黃芪甲苷

13、(25、50mg/L)對缺氧心肌細胞的保護作用優(yōu)于小劑量的槲皮素(25mg/L)、黃芪甲苷(12.5mg/L)和維生素E(10mg/L)。 2．同等劑量下，黃芪甲苷(25、50mg/L)減輕細胞損傷、保護細胞活力的作用較槲皮素(50、100mg/L)更好，但二者在減輕細胞脂質過氧化損傷、提高SOD活力和清除ROS的作用上無顯著差異。 3．FITC標記的黃芪甲苷分子主要分布在胞漿中；HRP標記的黃芪甲苷分子特異性地分布在線

14、粒體膜上，在細胞膜和其他細胞器中未見分布。 4．在常氧和缺氧條件下，黃芪甲苷均能增加心肌細胞SOD-1 mRNA和蛋白表達量，從而加快胞內O<,2><'->歧化為H<,2>O<,2>和OH<'->的過程。進入細胞的黃芪甲苷又可以與OH<'->發(fā)生反應清除部分OH<'->，減少細胞內ROS的蓄積，減輕細胞膜、蛋白質、核酸等的氧化損傷，使SOD等細胞內源性抗氧化酶活性得以穩(wěn)定和提高，細胞內源性保護作用加強。 5．黃芪甲苷不能