氧化苦參堿調(diào)控MAPK信號保護(hù)TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本課題以體外培養(yǎng)的SD新生乳鼠心肌細(xì)胞為研究對象，采用TGF-β1復(fù)制心肌細(xì)胞損傷模型，研究 TGF-β1在介導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷過程中對MAPK信號通路的影響，進(jìn)一步研究氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT)對TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，探討OMT對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制，為OMT預(yù)防和治療心血管疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第一部分 TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷與MAPK信號通路的相關(guān)性
　　目的：探討TGF-

2、β1誘導(dǎo)的新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞損傷病理過程中絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族P38、c-Jun氨基端激酶（JNK)和ERK1/2信號的作用。
　　方法：采用胰酶消化法、差速貼壁法及化學(xué)抑制劑法分離、純化1-3 d新生SD大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)；倒置顯微鏡觀察正常細(xì)胞在48 h、72 h的形態(tài)學(xué)改變；免疫細(xì)胞化學(xué)法分析心肌細(xì)胞特異性肌動蛋白（ɑ-Sarcom

3、eric-actin，α-actin）、肌鈣蛋白(Cardiac Troponin T，c-TnT)，鑒定心肌細(xì)胞及其純度。采用MTT法觀察不同濃度的TGF-β1對心肌細(xì)胞影響，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，TGF-β1濃度分別設(shè)定為1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL，研究TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的量毒關(guān)系，最終確定TGF-β120 ng/ml、作用時(shí)間48 h作為心肌細(xì)胞損傷模型復(fù)制條件；

4、實(shí)驗(yàn)共分為9組：正常對照組(Ctrl)，TGF-β1，TGF-β1 inhibitor(I)組，TGF-β1+P38 I組，TGF-β1+JNK I組，TGF-β1+ERK1/2 I，TGF-β1+TGF-β1 I＋P38 I組，TGF-β1+TGF-β1 I+JNK I組，TGF-β1+TGF-β1 I+ERK1/2 I組；MTT法檢測細(xì)胞的存活率，LDH外漏分析細(xì)胞膜損傷程度，Giemsa染色法從形態(tài)學(xué)上觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

5、，Western blot檢測各組p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、t-P38、t-JNK及t-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞貼壁后呈多邊形，48 h后細(xì)胞開始出現(xiàn)偽足，并且出現(xiàn)搏動，72 h成簇生長；免疫細(xì)胞化學(xué)法對心肌細(xì)胞特異性蛋白α-actin、c-TNT鑒定，其表達(dá)結(jié)果呈陽性，即胞漿中有棕黃色顆粒出現(xiàn)，且純度達(dá)到92％；TGF-β1(20 ng/mL，48 h)作用心肌細(xì)胞后

6、，OD490值降低（P<0.01)，而LDH外漏量升高(P<0.05)；各阻斷劑組處理之后MTT法測得的OD490值升高（P<0.05或者P<0.01)，LDH外漏量降低（P<0.05或者P<0.01)，且 TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+P38 I、TGF-β1+P38 I組之間，TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+JNK I、TGF-β1+JNK I組之間，TGF-β1+TG

7、F-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+ERK I、TGF-β1+P38 I組之間OD490值與乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）外漏量進(jìn)行比較，均未見顯著性差異；Giemsa染色法證實(shí)TGF-β1可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷，而各阻斷劑組可以降低TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TGF-β1可使心肌細(xì)胞p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.01)，

8、而各阻斷劑組抑制p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)（P<0.01)，且TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+P38 I、TGF-β1+P38 I組之間，TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1I+JNK I、TGF-β1+JNK I組之間，TGF-β1+TGF-β1 I、TGF-β1+TGF-β1 I+ERK I、TGF-β1+P38 I組之間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而各個(gè)

9、組總蛋白的表達(dá)均無差異。
　　結(jié)論：TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制與 p-P38、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān),并且MAPK是TGF-β1的下游信號。
　　第二部分 OMT調(diào)控MAPK信號保護(hù)TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷
　　目的：建立TGF-β1誘導(dǎo)新生SD大鼠原代心肌細(xì)胞損傷模型，探討OMT對TGF-β1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對MAPK家族成員P38、JNK、ERK1/2的影響，闡明

10、OMT對心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)理，為心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)疾病尋找新的切入點(diǎn)。
　　方法：原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)同第一部分。采用TGF-β1最佳濃度20 ng/ml、作用時(shí)間48 h進(jìn)行模型復(fù)制。實(shí)驗(yàn)共分為6組：Ctrl.，模型組(TGF-β1，20 ng/mL)，OMT高劑量組(OMT-H，0.1 mg/mL)、低劑量組(OMT-L，0.05 mg/mL)，阿司匹林組(Aspirin，Asp，10-5 mol/L)，丹酚酸B組(Salv

11、ianolic acid B，Sal B，50?mol/L)。MTT法檢測細(xì)胞的存活率，LDH外漏分析細(xì)胞膜損傷程度，Giemsa染色法從形態(tài)學(xué)上觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，Western blot檢測各組p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、t-P38、t-JNK及t-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：通過MTT實(shí)驗(yàn)，LDH試劑盒檢測以及Giemsa染色結(jié)果表明，OMT可有效的減少TGF-β1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。Wes