調節(jié)Notch-1信號系統(tǒng)對高糖誘導心肌細胞損傷的保護作用及機制.pdf

1、目的:
　　1.觀察高糖對H9c2心肌細胞增殖、凋亡及纖維化的影響。
　　2.觀察以Notch-1為靶點干預對高糖誘導的H9c2心肌細胞增殖、凋亡及纖維化的影響。
　　3.探討過表達Notch-1抑制高糖誘導的H9c2心肌細胞凋亡及纖維化的機制。方法:
　　1.體外低糖正常培養(yǎng)H9c2細胞,再分別運用高糖、γ分泌肽酶抑制劑(DAPT)和Notch-1過表達慢病毒進行干預。
　　2.實驗分六組:①Contro

2、l組:正常對照組,用5.5mmol/L低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細胞;②Mannitol組:甘露醇高滲對照組,用含33mmol/L甘露醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細胞;③High glucose組:陽性對照組,用含33mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細胞;④DAPT組:用Notch-1特異性阻斷劑γ分泌肽酶抑制劑(DAPT)干預H9c2細胞;⑤Notch-1組:感染Notch-1過表達病毒組;⑥GFP組:感染空載體慢病毒組。
　　3.

3、DAPT干預48h,慢病毒感染72h后,用CCK-8試劑盒檢測各組H9c2細胞的增殖抑制率;應用Annexin V-FITC/PI雙染色后流式細胞儀測各組H9c2細胞凋亡率并比較;同時應用qRT-PCR法分別測定各組H9c2細胞PI3K、AKT mRNA的表達;Western blot法測定各組H9c2細胞Notch-1、p-PI3K/p-AKT、Bax、Bcl-2、TGF-β1、collagen I蛋白的表達并比較。
　　結果:

4、
　　1.成功構建Notch-1過表達慢病毒載體,病毒滴度為2×108TU/ml;病毒感染72h,MOI=40時,病毒轉染效率最強。
　　2.CCK8試劑盒法測定各組H9c2心肌細胞增殖抑制率,結果顯示:高糖可使H9c2心肌細胞增殖抑制率增高,過表達Notch-1可使H9c2心肌細胞增殖抑制率下降,DAPT干預后H9c2心肌細胞增殖抑制率進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　3.Western Blot法

5、檢測各組H9c2心肌細胞Bax、Bcl-2表達,結果顯示:高糖可使Bax/Bcl-2比值增高,過表達Notch-1可使Bax/Bcl-2比值減小,DAPT干預后Bax/Bcl-2比值進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.應用Annexin V-FITC/PI雙染色后流式細胞儀測各組H9c2心肌細胞凋亡率并比較,結果顯示:高糖可使H9c2心肌細胞凋亡率增高,過表達Notch-1可使H9c2心肌細胞凋亡率減小,DAP

6、T干預后H9c2心肌細胞凋亡率進一步增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.Western blot法測定各組H9c2心肌細胞中TGF-β1、collagen I蛋白表達,結果顯示:高糖可使TGF-β1和collagen I表達上調,過表達Notch-1使TGF-β1和collagen I表達下調,DAPT干預后可使TGF-β1和collagen I上調達最高值,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　6.qRT-

7、PCR法測定各組H9c2心肌細胞中PI3K/AKT mRNA含量并比較,結果顯示:高糖可使PI3K/AKT mRNA表達下調,過表達Notch-1可使PI3K/AKT mRNA表達上調,DAPT干預后可使H9c2心肌細胞PI3K/AKT mRNA表達進一步下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　7.Western blot法測定各組H9c2心肌細胞Notch-1、p-PI3K/p-AKT蛋白的表達,結果顯示:高糖可使Notc

8、h-1、p-PI3K/p-AKT蛋白表達下調,過表達Notch-1可使p-PI3K/p-AKT蛋白表達上調,DAPT干預后p-PI3K/p-AKT蛋白表達進一步減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論:
　?、懦晒嫿薔otch-1過表達的慢病毒載體,并高效感染H9c2細胞。
　?、聘咛强烧T導H9c2心肌細胞發(fā)生凋亡及纖維化反應;過表達Notch-1能夠抑制高糖誘導的H9c2心肌細胞的凋亡和纖維化反應。