Trx及其抑制蛋白TXNIP對高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用.pdf

1、研究背景：
　　 當(dāng)前，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人民生活水平的提高，糖尿病(Diabetes Mellitus)已成為威脅人類生命健康的最重要疾病之一。最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國20歲以上糖尿病患者人數(shù)已達(dá)9240萬，是全世界糖尿病患者人數(shù)最多的國家。糖尿病的主要損害在于其引起的各種器官并發(fā)癥，以心臟并發(fā)癥的危害最重，是糖尿病患者死亡的主要原因。對糖尿病心臟損傷的機(jī)理已有大量研究，但仍主要集中在冠脈血管損傷以及炎癥反應(yīng)的影響，而高

2、糖高脂等對心肌細(xì)胞直接損傷的研究仍然較少。
　　 硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)系統(tǒng)是體內(nèi)重要的氧化還原蛋白系統(tǒng)，廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，具有抗自由基損傷、抗凋亡和促進(jìn)細(xì)胞生長的功能，在很多有自由基大量生成的疾病如缺血再灌注損傷等的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用。2009年和2010年我實驗室在高糖高脂誘導(dǎo)結(jié)合STZ注射制成的2型糖尿病大鼠在體模型和高糖高脂刺激培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞的離體模型上都觀察到明顯的心肌細(xì)胞凋亡

3、發(fā)生，同時伴有Trx活性的下降。在分析Trx活性下降的原因時，我們注意到糖尿病時內(nèi)源性的Trx相關(guān)蛋白(Trx interactingProtein，TXNIP)表達(dá)升高顯著。TXNIP是Trx的內(nèi)源性抑制蛋白，能與Trx結(jié)合而妨礙其功能。在糖尿病心肌損傷中TXNIP的表達(dá)顯著上調(diào)，提示TXNIP在糖尿病心肌細(xì)胞的損傷發(fā)生中起了重要的作用。
　　 目的：
　　 1.以高糖、高脂刺激模擬糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，給予外源性T

4、rx補(bǔ)充，提高Trx活性，觀察是否可以減輕心肌細(xì)胞的損傷，以確認(rèn)Trx在高糖、高脂引起的細(xì)胞損傷中的作用。
　　 2.以高糖、高脂刺激模擬糖尿病誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，使用RNA干擾技術(shù)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)源性TXNIP的表達(dá)，觀察是否可以提高心肌Trx功能從而減輕高糖高脂刺激引起的心肌細(xì)胞凋亡。
　　 方法：
　　 1.給予外源性Trx干預(yù)
　　 將處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為3組：正常對照組（普通DM

5、EM培養(yǎng)基葡萄糖5 mmol/L加入20 mmol/L甘露醇）、高糖高脂組（DMEM高糖25 mmol/L培養(yǎng)基加入高脂600μmol/L軟脂酸）、Trx干預(yù)組（在高糖高脂組的培養(yǎng)基中加入3μmol/L Trx）。培養(yǎng)48h后，分別收集培養(yǎng)基上清與細(xì)胞，測定LDH、caspase-3及Trx活性，并用western blot方法測定Trx的蛋白表達(dá)。
　　 2.驗證重組質(zhì)粒的抑制效果
　　 將處于對數(shù)生長期的H9c2細(xì)胞

6、隨機(jī)分成五組：正常對照組（即未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞），陰性對照組（即RNAi-HK組：轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒RNAi-HK的細(xì)胞），RNAi-TXNIP1組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒RNAi-TXNIP1的細(xì)胞），RNAi-TXNIP2組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒RNAi-TXNIP2的細(xì)胞），RNAi-TXNIP3組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒RNAi-TXNIP3的細(xì)胞）。說明：我們首先用質(zhì)粒RNAi-HK轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在24h、48h、72h熒光顯微鏡下觀察并計算轉(zhuǎn)染效率，從而尋找轉(zhuǎn)染效率最高的

7、時間。按照此時間對5組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染操作和培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)染效率最高的時間收集細(xì)胞用RT-PCR及Western blot方法檢測TXNIP的表達(dá)，分析RNA干擾效果。
　　 3.分析TXNIP在高糖高脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用
　　 通過前一部分實驗，我們篩選到對TXNIP抑制效率最高的RNAi-TXNIP3重組質(zhì)粒用于本部分實驗。實驗分為4組，將轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒RNAi-HK的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分成兩組：正常+RNAi-HK組（

8、使用含葡萄糖5mmol/L的DMEM培養(yǎng)基加入甘露醇20mmol/L作為對照培養(yǎng)基），高糖高脂+RNAi-HK組（使用含葡萄糖25mmol/L、軟脂酸600μmol/L的DMEM培養(yǎng)基作為該組培養(yǎng)基）；將轉(zhuǎn)染RNAi-TXNIP3的H9c2細(xì)胞隨機(jī)分成兩組：正常+RNAi-TXNIP3組（培養(yǎng)基同正常+RNAi-HK組）；高糖高脂+RNAi-TXNIP3組（培養(yǎng)基同高糖高脂+RNAi-HK組），四組均于培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)基上清和細(xì)胞，

9、測定TXNIP表達(dá)、LDH、caspase-3、Trx及p38激酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.外源性給予Trx干預(yù)結(jié)果
　　 1.1乳酸脫氫酶活性的變化
　　 與正常組比，高糖高脂組的乳酸脫氫酶活性顯著增高(260.50±11.35 vs.69.20±8.04，P＜0.01)，提示高糖、高脂可引起心肌細(xì)胞損傷；而Trx干預(yù)組，乳酸脫氫酶活性下降(90.63±6.03 vs.260.50±11.35，P

10、＜0.01)，表明外源給予Trx能顯著減少高糖、高脂的刺激對心肌細(xì)胞的損傷（見圖1）。
　　 1.2心肌細(xì)胞凋亡檢測
　　 本實驗通過caspase-3活性測定來檢測心肌細(xì)胞凋亡程度。caspase-3是caspase依賴性凋亡的最終共同途徑，通過特異性的裂解下游多聚ADP-核糖聚合酶PARP，激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，故可以通過測定其活性來反映細(xì)胞凋亡的程度。
　　 結(jié)果表明，與正常

11、組比，高糖、高脂的刺激可引起H9c2心肌細(xì)胞caspase-3活性顯著升高(1.68±0.04 vs.0.67±0.09，P＜0.01)，而Trx干預(yù)可顯著減輕高糖、高脂的刺激引起的心肌細(xì)胞凋亡(caspase-3活性0.87±0.05 vs.1.68±0.04，P＜0.01)（見圖2）。
　　 1.3 H9c2細(xì)胞Trx活性測定
　　 用胰島素還原法檢測H9c2心肌細(xì)胞Trx活性。與正常對照組比，高糖高脂組Trx的活性

12、顯著下降(0.28±0.048 vs.1.008±0.10，P＜0.01)，而與高糖高脂組比，Trx干預(yù)組Trx活性顯著提高(0.87±0.127 vs.0.28±0.04，P＜0.01)（見圖3）。
　　 1.4 Western blot檢測Trx蛋白的表達(dá)
　　 由Western blot顯色及條帶分析結(jié)果可見，與正常組比，高糖高脂組Trx表達(dá)未見明顯變化(1.07±0.07 vs.1.06±0.07，P＞0.05)

13、（見圖4），說明高糖、高脂的刺激未引起Trx蛋白量的改變。Trx干預(yù)組因加入大量外源性Trx蛋白，其Western blot檢測無明顯價值，故未做分析。
　　 2.驗證重組質(zhì)粒的抑制效果的實驗結(jié)果
　　 2.1熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率
　　 我們先用陰性對照組的重組質(zhì)粒RNAi-HK轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別在24h、48h、72h不同時間點(diǎn)用熒光顯微鏡觀察H9c2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果可見三組H9c2細(xì)胞胞漿內(nèi)均有GFP呈現(xiàn)的

14、綠色熒光，表明有細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。通過計算綠色熒光細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞24h、48h、72h后的轉(zhuǎn)染效率分別為10.94±1.02％、81.86±5.43％、48.30±5.67％，可以看出轉(zhuǎn)染48h的轉(zhuǎn)染效率顯著高于轉(zhuǎn)染24h(P＜0.01)和轉(zhuǎn)染72h(P＜0.01)（見圖8），故我們選擇此時間點(diǎn)用于后續(xù)瞬時轉(zhuǎn)染靶基因表達(dá)抑制率的分析。
　　 2.2檢測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后對TXNIP的干擾效果
　　

15、2.2.1 RNAi對TXNIP mRNA表達(dá)影響
　　 與正常組比，H9c2心肌細(xì)胞TXNIP mRNA相對表達(dá)量在RNAi-HK組無顯著變化(0.92±0.05 vs.1.025±0.025,P＞0.05)，在RNAi-TXNIP1、RNAi-TXNIP2和RNAi-TXNIP3組TXNIP的mRNA水平顯著下降，分別為0.34±0.02 vs.1.02±0.02(P＜0.01)，0.62±0.082 vs.1.02±0.0

16、2(P＜0.01)和0.24±0.05 vs.1.02±0.02(P＜0.01)（見圖11），表明構(gòu)建的3個重組質(zhì)粒均能降低TXNIP mRNA的表達(dá)，抑制率分別為66％、38％和76％，其中以RNAi-TXNIP3組抑制效率最高。
　　 2.2.2 RNAi對TXNIP蛋白表達(dá)影響
　　 與正常組比，H9c2心肌細(xì)胞TXNIP蛋白相對表達(dá)量在RNAi-HK組無顯著變化(0.84±0.04 vs.0.92±0.02，P＞

17、0.05)，在RNAi-TXNIP1、RNAi-TXNIP2和RNAi-TXNIP3組顯著下降，分別是0.44±0.03 vs.0.92±0.02(P＜0.01)、0.68±0.06 vs.0.92±0.02，(P＜0.01)和0.26±0.01 vs.0.92±0.02，(P＜0.01)（見圖12）。以上結(jié)果顯示，三條干擾片段均能干擾TXNIP蛋白表達(dá)，抑制率分別為56％、32％和74％。綜合RT-PCR和western blot結(jié)果

18、分析，重組質(zhì)粒RNAi-TXNIP3對H9c2細(xì)胞TXNIP基因的沉默效果最為明顯。故我們選用重組質(zhì)粒RNAi-TXNIP3完成后續(xù)實驗。
　　 3.運(yùn)用TXNIP干擾質(zhì)粒分析TXNIP在高糖高脂誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用
　　 3.1 TXNIP表達(dá)的測定
　　 3.1.1 TXNIP mRNA表達(dá)改變
　　 與正常+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-HK組TXNIP mRNA表達(dá)顯著增加（1.40±

19、0.03vs.1.0±0.06，P＜0.01），而正常+RNAi-TXNIP3組TXNIP mRNA表達(dá)顯著降低(0.24±0.15 vs.1.0±0.06，P＜0.01)，與高糖高脂+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3組TXNIP mRNA表達(dá)顯著降低(0.47±0.04 vs.1.40±0.03，P＜0.01)（見圖14）。
　　 3.1.2 TXNIP蛋白表達(dá)改變
　　 與正常+RNAi-HK組比

20、，高糖高脂+RNAi-HK組TXNIP蛋白表達(dá)顯著增加（1.80±0.05 vs.0.92±0.05，P＜0.01），而正常+RNAi-TXNIP3組TXNIP蛋白表達(dá)顯著降低(0.26±0.04 vs.0.92±0.05，P＜0.01)；與高糖高脂+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3組TXNIP蛋白表達(dá)顯著降低(0.30±0.04 vs.0.92±0.05，P＜0.01)（見圖15）。
　　 以上結(jié)果說明高糖

21、高脂刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞TXNIP表達(dá)顯著增加，給予RNA干擾后明顯抑制了TXNIP的固有表達(dá)，并且可以顯著抑制高糖高脂刺激引起的TXNIP表達(dá)。
　　 3.2乳酸脫氫酶活性測定
　　 與正常+RNAi-HK組比，H9c2心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶活性在高糖高脂+RNAi-HK組顯著增高(260.50±11.35 vs.69.20±8.04，P＜0.01)；與高糖高脂+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3組顯著降低（

22、106.90±13.16 vs.260.50±11.35，P＜0.01）（見圖16）。這表明抑制TXNIP表達(dá)能減少高糖高脂刺激引起心肌細(xì)胞損傷。
　　 3.3 caspase-3活性分析
　　 與正常+RNAi-HK組比，H9c2心肌細(xì)胞caspase-3活性在高糖高脂+RNAi-HK組顯著增高（1.68±0.04 vs.0.68±0.09 P＜0.01）；與高糖高脂+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP

23、3組顯著降低（1.03±0.08 vs.1.68±0.04; P＜0.01）（見圖17）。這表明抑制TXNIP表達(dá)能減少高糖高脂刺激引起心肌細(xì)胞凋亡。
　　 3.4 Trx活性分析
　　 與正常+RNAi-HK組比，H9c2心肌細(xì)胞Trx活性在高糖高脂+RNAi-HK組顯著降低(0.28±0.04 vs.1.00±0.09，P＜0.01)；與高糖高脂+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3組Trx活性顯著升

24、高(0.44±0.12 vs.0.28±0.04;P＜0.05)（見圖18），提示抑制TXNIP的表達(dá)可以減輕高糖高脂刺激時Trx活性的抑制，也證明高糖高脂時TXNIP是通過抑制Trx活性誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷和凋亡的。
　　 3.5 p38激酶活性分析
　　 與正常+RNAi-HK組比，H9c2心肌細(xì)胞p38激酶活性在高糖高脂+RNAi-HK組顯著增高(1.86±0.09 vs.1.05±0.09，P＜0.01)；與高糖高脂

25、+RNAi-HK組比，高糖高脂+RNAi-TXNIP3組顯著降低了高糖高脂刺激引起的細(xì)胞p38激酶活性的升高(1.24±0.16 vs.1.86±0.09;P＜0.01)（見圖19）。已有研究證明Trx可以抑制ASK1活性，而p38激酶位于ASK1的下游，p38激酶活化后可激活caspase-3而引起細(xì)胞凋亡，因而我們推測TXNIP是通過抑制Trx的功能而促進(jìn)ASK1的活化，進(jìn)而通過p38激酶引起凋亡的。
　　 結(jié)論：