高糖毒性對心肌細(xì)胞的直接傷害作用及Ghrelin干預(yù)研究的探索.pdf

1、糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成為21世紀(jì)世界流行病之一，據(jù)統(tǒng)計到2010年患病人數(shù)達(dá)2.40億，到2025年可達(dá)2.99億。由于糖尿病可以引起冠心病、腦卒中、失明、截肢等嚴(yán)重后果，糖尿病及其并發(fā)癥的防治已經(jīng)給各國造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和社會壓力。心血管疾病是DM患者致殘、致死，并造成經(jīng)濟損失的主要原因，現(xiàn)已把防治心血管并發(fā)癥作為當(dāng)今治療DM的主題，也就是說完成了從DM的昏迷時代到感染時代到心血管時代的飛躍。

2、　　 糖尿病是冠心病的等危癥，糖尿病引起心血管并發(fā)癥的危害性已逐漸受到重視。目前，糖尿病對心臟的損害局限于對大血管、微血管、動脈粥樣硬化的研究，國內(nèi)外對糖毒性對心肌細(xì)胞的直接傷害報道少見。本文通過以體外培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞為模型，探討不同糖濃度環(huán)境下心肌細(xì)胞糖代謝狀況的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高糖情況下心肌細(xì)胞存在胰島素抵抗及凋亡，揭示糖毒性對心肌細(xì)胞存在直接傷害作用，為糖尿病對心臟的損害闡明另一途徑。
　　 Ghrelin是1999年日

3、本科學(xué)家Kojima等從大鼠胃組織中分離和純化了一個由28個氨基酸組成的小分子活性肽，并證實其為生長激素促分泌物受體(Growthhormone secretagogue receptor，GHS-R)的內(nèi)源性配體。研究表明ghrelin在心血管的能量代謝、內(nèi)分泌效應(yīng)、血管效應(yīng)及細(xì)胞效應(yīng)方面發(fā)揮了廣泛的作用，Ghrelin對于心血管系統(tǒng)的作用提示其可能在心衰、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)及心肌損傷等病變的防治上具

4、有廣闊的前景。
　　 目前國內(nèi)外并未見ghrelin干預(yù)后心肌細(xì)胞糖代謝的變化及對糖毒性的影響的報道。我們知道PI3-Kinase/AKT通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這條通路不僅在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到很重要的作用，同時也是細(xì)胞凋亡過程中重要的一環(huán)。本研究利用RT-PCR及Western方法對不同濃度葡萄糖的大鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行mRNA及蛋白定量檢測，揭示出Ghrelin對高糖作用下的心肌細(xì)胞起到保護作用的機制。本文力求對高糖引起

5、的心肌細(xì)胞的直接傷害作用及Ghrelin的功能的深入研究作出貢獻(xiàn)，為臨床治療提供新的方向與思路。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料
　　 1、H9C2大鼠心肌細(xì)胞系；
　　 2、3H-G(3氚標(biāo)記-葡萄糖)心肌細(xì)胞糖攝取實驗相關(guān)試劑；
　　 3、免疫熒光染色的相關(guān)試劑；
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測凋亡的相關(guān)試劑；
　　 5、半定量RT-PCR檢測基因mRNA的相關(guān)試劑；

6、　　 6、Western印跡雜交相關(guān)試劑；
　　 二、實驗方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)鼠胚心肌細(xì)胞(H9C2)在DMEM培養(yǎng)基和10％胎牛血清中于37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞單層生長達(dá)80％培養(yǎng)面積后，用0.25％胰蛋白酶消化，根據(jù)情況1:2或1:3傳代，將傳至6-7代的細(xì)胞用于實驗。當(dāng)細(xì)胞呈對數(shù)生長后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，接種于6孔培養(yǎng)板或30 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)后用無血清培養(yǎng)

7、基培養(yǎng)24h使細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)，更換實驗用液隨機分配為實驗組及對照組進(jìn)行實驗。
　　 2、實驗分組
　　 A、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素；
　　 B、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素；
　　 C、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-8mol/L Ghrelin；
　　 D、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-8mol/L Ghre

8、lin；
　　 E、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-7mol/L Ghrelin；
　　 F、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰島素+10-7mol/L Ghrelin。
　　 3、同位素示蹤法檢測不同葡萄糖濃度時，心肌細(xì)胞3氚標(biāo)記-葡萄糖(3H-G)攝取的變化待傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞處于80-90％融合狀態(tài)時用于實驗。KRH緩沖液洗滌細(xì)胞3次。用400ulKRH孵育細(xì)胞37℃孵育30mi

9、n。棄去緩沖液，各組分共同繼續(xù)孵育30分鐘。加入3H-G至終濃度0.2uCi/ml30分鐘。用預(yù)冷的PBS沖洗3次，將細(xì)胞裂解于0.5mol/LNaOH中，吹打混勻細(xì)胞(37℃裂解2小時)，收集細(xì)胞并離心(800r，2min)。樣品移至液閃瓶內(nèi)，加入液閃液(PPO4.0g、POPOP0.1g/1000ml二甲苯)2ml，液體閃爍計數(shù)法測定檢測各組的CPM值。
　　 4、吖啶橙(Acridine Orange，AO)熒光染色各實驗

10、組細(xì)胞按上述分組處理后，吸棄各孔中上清，PBS漂洗3次，每次3min，95％冷乙醇固定20min，濾紙吸干，1％醋酸作用30s，PBS洗1 min，加入0.01％AO染色5 min，PBS洗1 min，分色30 s，PBS洗3次，封片，于激發(fā)波長為405nm的熒光相差顯微鏡下立刻觀察。
　　 5、Hoechst33258染色將實驗各組細(xì)胞按上述分組處理后，吸棄各孔中上清，PBS漂洗2次，每次3min，加入1 ml的4％甲醛溶液，

11、4℃固定細(xì)胞10min，棄去固定液，PBS洗二次，滴加100μL Hoechst33258工作液，室溫染色10min，流水沖凈，于340nm波長的熒光顯微鏡下觀察。
　　 6、流式細(xì)胞儀檢測H9C2細(xì)胞凋亡率細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中，每樣本細(xì)胞數(shù)為(1～5)×106/mL，500～1000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000r/min離心5min。用100ul的標(biāo)記溶液

12、重懸細(xì)胞，室溫下避光孵育10～15min。500～1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm，用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560nm的濾器檢測PI。采用Cell QUEST軟件進(jìn)行采集分析。
　　 7、細(xì)胞總RNA的提取及半定量RT-PCR檢測GLUT4、PI3K、A

13、KT/PKB、PPARr，LXRα、AMPK的表達(dá)誘導(dǎo)后的細(xì)胞處于80-90％融合狀態(tài)時用于實驗。PBS輕微沖洗2次后，細(xì)胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24小時后，25mmol/l葡萄糖濃度下，分組同前，各組分別干預(yù)后，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕微沖洗2次后，加入冰預(yù)冷的Trizol1ml，采用一步法提取細(xì)胞總RNA。細(xì)胞總RNA提??；RNA純度及濃度測定；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：cDNA第一鏈合成(反轉(zhuǎn)錄)；GLUT4、PI3K、AKT/P

14、KB、PPARγ、LXRα、AMPK的引物序列及反應(yīng)條件；制備3％瓊脂糖凝膠；電泳；測定電泳條帶密度值；掃描成像分析。
　　 8、Western blot(免疫印記)檢測磷酸化AKT蛋白變化特點(24h)及檢測PAKT、PBad、Bcl-2、Bax蛋白的變化(48h)誘導(dǎo)后的細(xì)胞處于80-90％融合狀態(tài)時用于實驗。PBS輕微沖洗2次后，細(xì)胞在無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育24小時及48h后，25mmol/l葡萄糖濃度下，分

15、組同前，各組分別干預(yù)后收集細(xì)胞。蛋白收集及提??；蛋白質(zhì)濃度測定；SDS-PAGE電泳；轉(zhuǎn)膜；雜交；堿性磷酸酶顯色；掃描成像分析。
　　 9、分光光度計檢測caspase-3活性收集實驗各組細(xì)胞(3×106/組)，PBS洗二次，2000 r/min離心5 min，去除PBS，沉淀細(xì)胞中加入50μL冰冷裂解液和0.5μL DTT，吹打，冰上裂解60min，期間渦旋4次，每次10 s，4℃10000 r/min離心1min，吸取上清至

16、新管中置冰上，測蛋白濃度，各組采用同樣蛋白量進(jìn)行實驗，加50μL2×ReactionBuffer/DTTMix及DEVD-fmk1mL，冰浴30 min，加5μL Ac-DEVD-pNA，37℃2h。分光光度計在405nm波長測定其吸光值，計算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對照確定各組caspase-3活化程度。
　　 10、統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用單因素方差分析比較組間差異，

17、P<0.05差異有顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1、不同葡萄糖濃度時，心肌細(xì)胞培養(yǎng)24小時3氚標(biāo)記-葡萄糖(3H-G)及Ghrelin干預(yù)后攝取情況：與5.5mmol/l葡萄糖組比較，高糖組25.0mmol/l葡萄糖作用下3H-G攝取明顯降低(P<0.01)。Ghrelin10-8mol/L干預(yù)后，心肌細(xì)胞3H-G攝取有所升高(P>0.05)；Ghrelin10-7mol/L干預(yù)后，心肌細(xì)胞3H-G攝取明顯升高(P<0.

18、05)。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測H9C2細(xì)胞凋亡率：不同葡萄糖濃度及Ghrelin干預(yù)后心肌細(xì)胞培養(yǎng)48小時，與5.5mmol/l葡萄糖組比較，高糖組25.0mmol/l葡萄糖作用下心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加；Ghrelin10-7mol/L干預(yù)后，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低。
　　 3、RT-PCR檢測PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPK mRNA表達(dá)：PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPKmR

19、NA高糖組水平明顯降低(P<0.01或P<0.05)；10-8mol/L Ghrelin作用下水平升高不明顯(P>0.05)；10-7mol/LGhrelin作用下水平明顯升高(P<0.01或P<0.05)；說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有升高PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPK mRNA表達(dá)的作用，而10-8mol/L濃度時該作用不明顯。
　　 4、Western blot法檢測磷酸化PI3K\

20、AKT蛋白變化特點(心肌細(xì)胞培養(yǎng)24小時)：高糖組PAKT水平明顯降低(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，PAKT水平升高不明顯(P>0.05)；10-7 mol/L Ghrelin作用下，PAKT水平明顯升高(P<0.01)；說明ghrelin在10-7 mol/L濃度時具有升高PAKT蛋白表達(dá)的作用，而10-8 mol/L濃度時該作用不明顯。
　　 5、Western blot法檢測PAKT、PBad

21、及Bcl2、Bax蛋白變化特點(心肌細(xì)胞培養(yǎng)48小時)：高糖組PAKT、PBad及Bcl2明顯降低(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，PAKT、PBad及Bcl2水平升高不明顯(P>0.05)；10-7mol/L Ghrelin作用下，PAKT、PBad及Bcl2水平明顯升高(P<0.01)；說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有升高PAKT、PBad及Bcl2蛋白表達(dá)的作用，而10-8 mol/L濃度

22、時該作用不明顯。免疫印跡法半定量Bax蛋白表達(dá)：高糖組Bax水平明顯升高(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，Bax水平變化不明顯(P>0.05)；10-7mol/L Ghrelin作用下，Bax水平下降(P<0.05)；說明ghrelin在10-7mol/L濃度時具有降低Bax蛋白表達(dá)的作用，而10-8 mol/L濃度時該作用不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1、高糖對心肌細(xì)胞的直接傷害作用表現(xiàn)為抵抗

23、和凋亡并存。
　　 2、Ghrelin干預(yù)后可以改善高糖引起的心肌細(xì)胞的胰島素抵抗；Ghrelin10-7mol/L可以防止心肌細(xì)胞的凋亡，故Ghrelin在高糖濃度下對心肌細(xì)胞有保護作用。
　　 3、不同葡萄糖濃度下，Ghrelin改變了葡萄糖攝取的GLUT4 mRNA表達(dá)水平，Ghrelin通過GLUT4促進(jìn)糖攝?。籊hrelin改變了AMPKmRNA的表達(dá)水平，說明AMPK在高糖毒性時參與了心肌細(xì)胞的葡萄糖攝取。<