睪酮對小鼠心肌細胞衰老的干預(yù)作用及其機制.pdf

1、目的和意義： 世界各國人口都以不同的速度邁進或加速著人類社會老齡化進程，而老年人心血管疾病患病率升高是一個不容忽視的問題。慢性心力衰竭是一種進行性的、致命性的復(fù)雜臨床癥候群，是各種心臟病的嚴重階段，大多數(shù)病程呈進行性惡化，發(fā)病率高，病死率甚至高于惡性腫瘤。對心力衰竭發(fā)病機制的研究以及防治，一直是心臟病學(xué)界研究的熱點。而心力衰竭的患病率與年齡存在著一定的相關(guān)性。美國心臟病學(xué)會的一項調(diào)查顯示，65歲以上老年人心衰患病率為10‰，是2

2、0至34歲人群的70倍，并遠遠高于其他65歲以下人群。接近80%的住院心衰病人是65歲以上的老年人。 研究發(fā)現(xiàn)，作為人體的重要器官，心臟隨增齡會發(fā)生一系列的變化，稱為心臟衰老。心臟衰老是一個持續(xù)且不可逆的過程，其解剖學(xué)表現(xiàn)為心室重量減少和室壁厚度增加。功能學(xué)表現(xiàn)可總結(jié)為心臟儲備能力降低以及對負荷的適應(yīng)力下降。具體表現(xiàn)為左室收縮和舒張功能隨增齡而下降，心輸出量峰值下降，最大心率下降；對兒茶酚胺的反應(yīng)性降低，對腎上腺素能受體刺激的反

3、應(yīng)降低，對壓力感受器和化學(xué)感受器的反應(yīng)性下降，而循環(huán)中兒茶酚胺、內(nèi)皮素-1水平升高等。這些都是被廣泛報道的衰老引起的心臟損害。另外，冠狀動脈內(nèi)膜增厚，血管僵硬度增加，內(nèi)皮細胞功能損傷，冠狀動脈系統(tǒng)和微血管系統(tǒng)相對缺乏，氧的獲得和利用能力降低，使心肌發(fā)生缺血缺氧。并且，衰老的心臟對各種不利因素的適應(yīng)性與正常年輕的心臟也不同，如對心肌缺血，收縮壓升高等病理狀況更為敏感，提示衰老心臟的保護機制降低。以上這些證據(jù)說明，心臟衰老是老年人心衰患病率

4、升高的主要原因之一。 心臟衰老主要由心肌細胞的衰老和死亡累積形成。有證據(jù)顯示，老齡大鼠在心衰形成之前，存在有心肌細胞的衰老和喪失，提示二者之間具有某種聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，心臟中主要的功能細胞心肌細胞在衰老過程中逐漸出現(xiàn)衰老并凋亡，總體數(shù)量持續(xù)減少。健康男性從55歲到95歲，心肌細胞逐漸喪失，左室平均每年喪失4．5千萬個細胞，右室喪失1．9千萬個細胞，這種喪失以凋亡為主要形式，而心肌細胞的凋亡是心臟衰老的特征之一，屬于心臟衰老過程的一

5、部分，是衰老心肌細胞的最終歸宿。心臟剩余的心肌細胞代償性肥大，而功能逐漸下降，出現(xiàn)動作電位延長，對β腎上腺素能刺激反應(yīng)減弱，收縮力降低，肌球蛋白重鏈異構(gòu)體改變，肌漿網(wǎng)ATP酶表達減少，鈉/鈣交換減少，胞漿內(nèi)鈣超負荷，心肌細胞興奮-收縮偶聯(lián)失調(diào)，對應(yīng)激的適應(yīng)力降低，eNOS和iNOS的表達失調(diào)，凋亡和壞死的易感性增加等一系列改變。以上這些衰老心肌細胞的改變均可導(dǎo)致心臟功能的降低。在分子水平上，衰老引起心肌細胞發(fā)生線粒體DNA突變和端?？s短

6、，加劇氧化應(yīng)激，改變基因和蛋白的表達以及翻譯后修飾，并使NAD（P）H氧化酶升高，蛋白羰基形成，AGE水平升高等等。因此，如果能干預(yù)心肌細胞的衰老，對改善心臟器官衰老及預(yù)防心力衰竭的發(fā)生具有重要的意義。 在增齡過程中，另一個顯著變化是性激素平衡的改變。睪酮是男性體內(nèi)最重要的雄激素，屬于一種合成激素，研究發(fā)現(xiàn)，男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現(xiàn)明顯下降。老年男性血漿睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率呈負相關(guān)。多項睪酮

7、替代治療的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，睪酮可改善老年人認知能力、調(diào)整肌肉脂肪比例，加強肌肉力量，增強運動能力，抑制血脂異常，減少胰島素抵抗，改善性功能等等，但睪酮能否改善老年男性的心功能，延緩老年性心力衰竭的發(fā)生，文獻未見報道。我們之前的研究表明，睪酮在體外干預(yù)血管內(nèi)皮細胞可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞衰老，但對心肌細胞函待研究。 因此，本研究用不同劑量睪酮干預(yù)小鼠心肌細胞，通過對衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性和細胞周期的測定，探討體外培養(yǎng)28日齡

8、小鼠心肌細胞是否發(fā)生衰老以及睪酮對心肌細胞衰老是否具有干預(yù)作用，并且通過對細胞內(nèi)ROS水平，細胞周期調(diào)控因子cyclinD1、p16INK4a、去磷酸化Rb的表達，IGF-1mRNA和蛋白表達，端粒相對長度測定及線粒體DNA突變率的變化這些可能機制的研究來探討心肌細胞衰老的機制以及睪酮干預(yù)的可能途徑。 方法： 1、心肌細胞的培養(yǎng)及分組：按文獻報道方法培養(yǎng)昆明白小鼠原代心肌細胞，鑒定后按以下分組： 1）正常組：3日

9、齡心肌細胞； 2）衰老組：28日齡心肌細胞； 3）1μmol/L睪酮組； 4）100nmol/L睪酮組； 5）10nmol/L睪酮組。各睪酮干預(yù)組均自3日齡起加入相應(yīng)濃度睪酮至28日齡止。 2、使用碘化丙啶染色法用流式細胞儀測定各組細胞周期分布，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色法測定各組染色陽性面積。 3、用相應(yīng)方法測定以下各指標： 1）2，7-二氯氫化熒光素二脂（H2DCFH-DA）探

10、針檢測各組細胞內(nèi)ROS水平； 2）用RT-PCR及Western-blot法檢測各組細胞周期調(diào)控因子cyclinD1，p16INK4amRNA和蛋白表達以及去磷酸化Rb蛋白表達； 3）用RT-PCR及Western-blot法檢測各組IGF-1mRNA和蛋白表達； 4）定量熒光原位雜交法用流式細胞儀檢測各組端粒相對長度； 5）提取各組細胞DNA，用PCR法檢測各組線粒體DNA突變率。 4、統(tǒng)計分析

11、：采用SPSS11．5統(tǒng)計軟件進行分析。所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較，采用LSD法。線性相關(guān)性分析采用線性趨勢檢驗。P<0．05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1、各組細胞周期比例及衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性面積： 衰老組28同齡小鼠心肌細胞G0/G1期比例較正常組3日齡心肌細胞明顯升高（p=0．000），S期比例明顯降低（p=

12、0．002），G2/M期比例也明顯下降（p=0．000），符合衰老細胞特征。1μM、100nM、10nM睪酮干預(yù)均可使細胞G0/G1期比例較衰老組明顯降低（p=0．000； p=0．003和p=0．025），S期比例明顯上升（p=0．000； p=0．002和p=0．041），G2/M期比例也明顯升高（p=0．007； p=0．019和p=0．042）。G0/G1期比例與睪酮劑量的線性關(guān)聯(lián)性為0．783，S期比例與睪酮劑量的線性關(guān)聯(lián)性為

13、0．812，G2/M期比例與睪酮劑量的線性關(guān)聯(lián)性為0．616。 β-半乳糖苷酶染色顯示衰老細胞胞漿與胞核藍染，定為陽性細胞。計算各組染色陽性面積比較發(fā)現(xiàn)，衰老組細胞染色陽性面積較正常組明顯升高（p=0．000），符合衰老細胞特征。1μM、100nM、10nM睪酮干預(yù)使染色陽性面積較衰老組明顯降低（p=0．000）。將衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性面積與睪酮干預(yù)濃度進行線性趨勢檢驗，二者線性關(guān)聯(lián)性為0．995。 2、用相應(yīng)

14、方法檢測以下指標探討心肌細胞衰老及睪酮干預(yù)作用機制 1）各組細胞周期調(diào)控因子的表達 衰老組p161NK4a mRNA表達較正常組明顯升高（p=0．000），1uM、100nM、10nM睪酮干預(yù)可下調(diào)p16INK4amRNA表達（p=0．000； p=0．001和p=0．018）。 衰老組cyclinD1mRNA表達較正常組明顯降低（p=0．000），1uM睪酮可上調(diào)cyclinD1mRNA表達（p=0．021）。

15、100nM和10nM睪酮干預(yù)無明顯作用（p=0．569和p=0．640）。 與正常組p16INK4a蛋白表達相比，衰老組表達明顯上升（p=0．001），1μM及100nM睪酮可降低p16INK4a蛋白表達（p=0．013和p=0．045），10nM睪酮對p16INK4a蛋白表達無顯著影響（p=0．642）。 2）各組細胞IGF-1的表達 衰老組IGF-1 mRNA表達較正常組明顯降低（p=0．000），1μM和1

16、00nM睪酮干預(yù)可增強IGF-1 mRNA表達（p=0．007和p=0．033），但10nM睪酮干預(yù)無顯著性影響（p=0．098）。 3）各組細胞內(nèi)ROS水平 衰老細胞經(jīng)過H2DCF-DA染色后可見細胞呈綠色熒光，各組相對熒光強度代表細胞內(nèi)ROS水平。衰老組細胞內(nèi)ROS水平較正常組明顯升高（p=0．000），各劑量睪酮干預(yù)（1μM-10nM）均可降低細胞內(nèi)ROS水平（p=0．000）。 結(jié)論： 1、與3日

17、齡原代小鼠心肌細胞相比，經(jīng)體外培養(yǎng)28日齡的小鼠心肌細胞出現(xiàn)細胞G0/G1期比例升高，S期比例降低，G2/M期比例也降低，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增強，p16INK4a mRNA和蛋白、去磷酸化Rb蛋白表達上升，cyclinD1mRNA和蛋白表達下降，細胞內(nèi)ROS水平升高，平均端粒長度縮短，線粒體DNA突變率增加，IGF-1 mRNA和蛋白表達下降等一系列改變，符合衰老細胞特征，證明自然衰老的小鼠心肌細胞模型構(gòu)建成功。 2、一