生理劑量睪酮延緩雄性小鼠心肌細胞衰老-非雄激素受體介導的途徑.pdf

1、人口老齡化是上個世紀末到本世紀初出現(xiàn)的一個世界性問題。目前世界老齡人口,即60歲及以上的人口達6.5億。到2050年,預計老齡化人口將達到20億,且80％的老年人將生活在發(fā)展中國家。我國到2010年,60歲以上老年人口已有1.74億,占全國總人口的12.78％;預計到2015年和2020年,這一比例將分別達到15％和18％。因此倡導健康老齡化,促進老齡人口的健康是衛(wèi)生提供者和社會的使命。理論上抗衰老治療可以改變衰老引起的生化和分子學方面

2、的變化,糾正衰老相關的生理學變化,減少對衰老相關疾病的易感性。美國抗衰老醫(yī)學學會(A4M)聲稱:“衰老相關的能力喪失由機體的生理功能障礙引起,許多情況下這些功能障礙可被內科治療所改善。人類的壽命可望延長,老年人的生活質量可望改善”。
　　 我國與發(fā)達國家的心力衰竭患者數(shù)量都在不斷增加,發(fā)病率和患病率也在逐步上升,其重要原因之一就是社會人口老齡化,隨著年齡的增長心力衰竭患病率升高。歐洲心臟病學會統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),在普通人群中心力衰竭的總患

3、病率約為2％-3％,而在70-80歲的老年人群中,則高達10％-20％。以往一直認為年齡屬于不可改變的因素,因而研究相對較少。但對傳統(tǒng)心力衰竭危險因素的分析不能完全解釋其發(fā)生易感性和進展速度易變性的特點。隨著年齡的增長,心力衰竭的易感性和進展速度均增加,其原因是心臟隨增齡發(fā)生了衰老變化。故年齡是心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的重要危險因素之一。因此,在日益人口老齡化的今天,研究心臟衰老可能對心力衰竭的防治具有重要的臨床意義。
　　 機體內環(huán)

4、境失衡可引起細胞生存和器官功能障礙,加速衰老進程。在增齡性變化的機制中也涉及到了性激素平衡的改變。睪酮是男性體內最重要的雄激素,調節(jié)著靶器官的生長發(fā)育與衰老過程。睪酮可通過與靶組織細胞內特異性雄激素受體(Aaadrogen receptor,AR)結合而發(fā)揮其生理作用。另外也可通過芳香化酶轉化為雌二醇而與雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結合,產生生物學效應。心臟是雄激素作用的靶器官,睪酮可通過與心肌細胞內AR或ER

5、結合對心臟起直接調節(jié)作用。男性50歲后體內總睪酮及生物活性睪酮水平顯著降低,與此同時雄激素靶器官的結構和功能隨之發(fā)生顯著變化。老年男性血清睪酮水平與多種增齡相關性疾病發(fā)病率呈負相關。與衰老相關的許多癥狀和體征,如性功能障礙、內臟性肥胖、骨骼和肌肉強度減弱及情緒障礙等均與雄激素缺乏的年輕男性患者相似。睪酮可促進細胞生長、增殖,同時具有抗凋亡、抗炎癥前細胞因子及抑制氧化應激等作用。已有研究發(fā)現(xiàn)睪酮缺乏與衰老相關的心血管疾病危險因素和部分心血

6、管疾病相關,如:代謝綜合征、胰島素抵抗、2型糖尿病、冠心病及心力衰竭等。這些結果提示雄激素缺乏與男性個體衰老之間可能存在著內在的聯(lián)系。Palm Springs預期壽命協(xié)會聲稱:“通過補充體內激素至年輕人水平有助于避免衰老相關的疾病,逆轉生物學年齡,延長預期壽命及有效改善生活質量”。睪酮替代治療雄激素缺乏患者已被普遍接受,睪酮治療可改善老年及去勢C57BL/6鼠的腦衰老(認知功能)。睪酮治療已作為治療心力衰竭的可選擇措施之一,可使心室肌細

7、胞的最大收縮峰值增加,還能增加心肌細胞的舒張速率。但睪酮替代治療糾正心力衰竭是否通過延緩心臟衰老本身,尚未見相關的文獻報道。那么,雄激素缺乏能否引起心臟衰老?睪酮替代治療能否延緩心臟衰老?對這些方面的研究可能為改善或延緩心力衰竭的發(fā)生提供重要的思路。
　　 心臟衰老是心臟隨增齡發(fā)生的結構和功能異常的變化。心臟衰老的結構異常表現(xiàn)為心室重量減少和左室壁厚度增加；心肌內膠原數(shù)量增加,其物理特性也發(fā)生改變,致僵硬度增加。心臟衰老的功能異

8、常表現(xiàn)可總結為心臟儲備能力降低以及對負荷的適應力下降。具體表現(xiàn)為左室收縮和舒張功能隨增齡而下降,而以舒張功能下降為主,左室舒張早期充盈率80歲時平均下降50％；最大心率下降,從20歲到85歲最大心率減少約30％；心輸出量峰值下降,心指數(shù)儲備下降；對兒茶酚胺的反應性降低,對腎上腺素能受體刺激的反應降低,對壓力感受器和化學感受器的反應性下降等。這些都是被廣泛報道的衰老引起的心臟損害。這些變化改變了心臟疾病發(fā)生的閾值、嚴重程度和預后。作為心臟

9、功能和收縮單元核心組成的心肌細胞,也是心臟衰老研究的核心。心肌細胞衰老時細胞總體數(shù)量持續(xù)減少,剩余細胞代償性肥大,肌漿網(wǎng)鈣泵ATP酶活性下降,收縮蛋白表達量及類型發(fā)生改變,細胞內氧化酶及抗氧化酶活性發(fā)生改變等,這一系列的變化被認為可導致心臟功能下降及心臟疾病發(fā)生增加。因此,干預心肌細胞的衰老可能改善心臟功能、延緩心臟疾病發(fā)生和發(fā)展。
　　 對心肌細胞衰老的研究也是圍繞衰老機制展開的。目前有關衰老機制的學說有數(shù)十多種,總體來說最終

10、歸結為兩大類型:一類是以自由基、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論,認為衰老是環(huán)境因素對細胞進行性和累積性毀壞的結果；另一類是以端?？s短、衰老基因、細胞周期調控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論,認為衰老是機體有序的基因活動,是通過遺傳按程序預先安排好的,或為特異的“衰老”基因所表達,或為可用基因的最終耗竭。這兩大類理論從不同角度闡述了機體衰老的可能機制,使衰老的研究不斷向細胞、分子和基因水平深入。由于衰老是一個復雜的過程

11、,環(huán)境與遺傳因素都影響著衰老的過程,因此當今有關衰老的研究已經(jīng)逐步走進了將這兩種理論進行合作的時代,并將發(fā)掘衰老的機制和延緩衰老的努力集中在一個相對明確的范圍之內,即集中在環(huán)境因子傷害造成的增齡性衰老改變的相關范圍之內。引起心肌細胞衰老的原因也可歸納為以上2個方面的損傷因素,即外源性因素和內源性因素。外源性因素或環(huán)境因素可影響內源性因素,共同作用最終決定心肌細胞衰老發(fā)生的步伐。
　　 基于上述這些觀點,我們假設雄激素缺乏這一外源

12、性環(huán)境因素可引起心肌細胞衰老,睪酮替代治療可延緩衰老的發(fā)生；而雄激素缺乏與睪酮治療對心肌細胞衰老的影響也是通過衰老機制中的外源性及內源性途徑共同作用的結果。本研究用去勢雄鼠和睪丸女性化(Testicular feminized,Tfm)小鼠作為雄激素缺乏模型。Tfm小鼠呈現(xiàn)AR編碼基因的X染色體連鎖的單堿基對缺失。這一缺失引起AR mRNA移碼突變,導致AR提前終止。故Tfm鼠表現(xiàn)為無功能的AR,同時先天的睪酮缺乏(僅為同窩對照鼠的1/

13、10)。Tfm鼠可作為研究雄激素缺乏和外源性睪酮作用途徑的良好實驗模型。因此,本研究圍繞以下兩個方面進行,不但可以回答上述提出的假設問題,同時由于Tfm鼠表達無功能的AR,可以探討睪酮對心肌細胞的作用是否通過其經(jīng)典的AR途徑。
　　 一、雄激素缺乏誘導小鼠心肌細胞衰老及生理劑量睪酮(Testosteronepropionate,T)的干預作用
　　 本研究以目前公認的衰老標志物:衰老相關β-半乳糖苷酶(Age-assoc

14、iatedβ-galactosidase,SAβ—gal)活性和細胞的相對端粒長度為主要觀察指標,首先對雄激素缺乏誘導心肌細胞衰老的可能性進行了實驗觀察。β-半乳糖苷酶活性采用免疫細胞化學染色方法,心肌細胞相對端粒長度采用Real-time定量PCR法測定。實驗分4組:正常組(24周齡C57BL/6J雄鼠,n=8),去勢組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢后正常飼養(yǎng)到24周,n=8),Tfm組(24周齡Tfm小鼠,n=7),去勢+T組(8

15、周齡C57BL/6J雄鼠去勢后正常飼養(yǎng)4周,肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個月,n=8)。取左心室心肌組織分離心肌細胞后,測定上述指標。結果顯示:與正常組相比,去勢組和Tfm組心肌細胞SAβ-gal藍染陽性面積平均光密度(Integrated optical density,IOD)值均明顯增加(P=0.000和P=0.000),而兩組藍染陽性面積IOD值相比無統(tǒng)計學差異(P=0.108)；去勢組和Tfm組心肌細胞相對端粒

16、長度均明顯縮短(P=0.000和P=0.000),而兩組相比無統(tǒng)計學差異(P=0.366)。這提示雄激素缺乏小鼠心肌細胞發(fā)生了衰老。
　　 此外,睪酮干預對心肌細胞衰老研究的結果顯示:與去勢組相比,給予生理劑量睪酮治療使心肌細胞SAβ-gal藍染陽性面積IOD值明顯降低(P=0.000),相對端粒長度明顯延長(P=0.002)。提示生理劑量睪酮治療可延緩心肌細胞衰老的發(fā)生。
　　 二、雄激素缺乏小鼠心肌細胞衰老及生理劑量

17、睪酮(T)干預的機制
　　 為了進一步探討雄激素缺乏及生理劑量睪酮對心肌細胞衰老影響的途徑及作用機制,我們觀察了生理劑量睪酮治療與未治療的小鼠心肌細胞各衰老相關指標的變化,及AR缺乏對睪酮治療的影響。實驗分5組:正常組(24周齡C57BL/6J雄鼠,n=8),去勢組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢后正常飼養(yǎng)到24周,n=8),Tfm組(24周齡Tfm小鼠,n=7),去勢+T組(8周齡C57BL/6J雄鼠去勢后正常飼養(yǎng)4周,肌肉注

18、射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個月,n=8),Tfm+T組(12周齡Tfm小鼠肌肉注射3.13mg/kg/72h丙酸睪酮3個月,n=8)。取左心室心肌組織分離心肌細胞后,比色法測超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,巢式PCR法測定心肌細胞線粒體DNA突變率,Real-time定量PCR法測定心肌細胞相對端粒長度,Western-blot法檢

19、測心肌細胞周期調控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達。結果顯示:(1)與正常組相比,去勢組和Tfm組SOD活性下降(P=0.011和P=0.028)；MDA含量升高(P=0.001和P=0.000)；線粒體DNA突變率增高(P=0.000和P=0.000)；相對端粒長度縮短(P=0.000和P=0.000)；周期調控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達量均顯著升高(p16INK4a:P=0.035和P=0.

20、005；Rb:P=0.000和P=0.000；p53:P=0.000和P=0.000)。而兩實驗組上述指標相比無統(tǒng)計學差異。(2)與去勢組相比,去勢+T組SOD活性增高(P=0.000)；MDA含量降低(P=0.000)；線粒體DNA突變率減低(P=0.008)；相對端粒長度延長(P=0.001)；周期調控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達量均下調(p16INK4a:P=0.024；Rb:P=0.000；p53:P=0.

21、000)。(3)與Tfm組相比,Tfm+T組SOD活性增高(P=0.038)；MDA含量降低(P=0.001)；線粒體DNA突變率減低(P=0.000)；相對端粒長度延長(P=0.000)；周期調控因子p16INK4a,去磷酸化Rb和p53蛋白表達量均下調(p16INK4a:P=0.002；Rb:P=0.000;p53:P=0.000)。(4)去勢+T組與Tfm+T組相比,上述各指標均無統(tǒng)計學差異。由于Tfm鼠表達無功能的AR,通過對其

22、與去勢小鼠睪酮治療后衰老相關指標的比較,提示生理劑量睪酮通過非經(jīng)典AR依賴的機制延緩心肌細胞衰老。
　　 結論:
　　 通過本研究,我們能夠得出以下結論:
　　 1.雄激素缺乏小鼠(去勢和Tfm小鼠)的心肌細胞出現(xiàn)衰老的細胞特征,提示雄激素缺乏可引起心肌細胞衰老。雄激素缺乏可通過增加細胞內氧化應激,增加線粒體DNA突變率,縮短相對端粒長度和上調細胞周期調控因子p16INK4a、去磷酸化Rb及p53蛋白的表達等途徑