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文檔簡(jiǎn)介
1、衰老是生命過(guò)程中整個(gè)集體形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐漸衰退現(xiàn)象的總稱,是生命過(guò)程的必然規(guī)律,不可抗拒。按照聯(lián)合國(guó)劃分標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看,當(dāng)一個(gè)社會(huì)65歲以上老年人占總?cè)丝?%以上時(shí),稱之為老年型。據(jù)第五次人口普查統(tǒng)計(jì)顯示,2000年,中國(guó)65歲以上老人達(dá)8883.44萬(wàn),占人口結(jié)構(gòu)比重為6.8%,與世界平均水平一致,2005年全國(guó)1%人口抽樣調(diào)查顯示,65歲及以上的人口為10045萬(wàn)人,占總?cè)丝诘?.69%,而至2009年,中國(guó)的老齡化比例已達(dá)8.3%,顯
2、著趕超世界平均水平7.5%。由此看出,中國(guó)已經(jīng)進(jìn)入了老齡化社會(huì),且中國(guó)人口變化的另一個(gè)顯著特點(diǎn)是有“未富先老”的趨勢(shì)。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,提高人群的生活質(zhì)量,延緩衰老成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。而衰老相關(guān)疾病中,老年人心血管疾病是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。
衰老一直是生命科學(xué)領(lǐng)域最基本和最神秘的研究之一,隨著衰老研究及分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展,衰老機(jī)制的研究已經(jīng)從細(xì)胞水平、亞細(xì)胞水平逐漸走向分子與基因水平,現(xiàn)已有研究表明,衰老是一個(gè)由基因調(diào)節(jié)的
3、過(guò)程,是預(yù)先設(shè)定的,當(dāng)前比較肯定的如klotho基因等抗衰老基因,但衰老也受環(huán)境因素以及生活方式的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前比較認(rèn)可的衰老的機(jī)制還包括如自由基損傷說(shuō)、生物膜損傷學(xué)說(shuō)、端粒縮短學(xué)說(shuō)、線粒體DNA損傷學(xué)說(shuō)、代謝產(chǎn)物交聯(lián)說(shuō)、體細(xì)胞突變說(shuō)、差錯(cuò)積累說(shuō)、免疫紊亂說(shuō)等等,有自由基學(xué)說(shuō)、線粒體DNA損傷學(xué)說(shuō)、端粒學(xué)說(shuō)、生物膜損傷學(xué)說(shuō)、遺傳程序?qū)W說(shuō)、染色體突變學(xué)說(shuō)、差錯(cuò)學(xué)說(shuō)、免疫學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)等。以及在2000年由Franceschi等首次提
4、出的炎性衰老??傮w來(lái)講上述這些學(xué)說(shuō)上可分為兩大類:即一類為以ROS、糖基化、激素紊亂等損害為代表的環(huán)境傷害衰老理論,另一類是以端??s短、細(xì)胞周期調(diào)控因子等為代表的遺傳因子程序化衰老理論,前者認(rèn)為衰老是環(huán)境因素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行性和累積性毀壞的結(jié)果;后者認(rèn)為衰老是機(jī)體有序的基因活動(dòng),是通過(guò)遺傳按程序預(yù)先安排好的,或?yàn)樘禺惖摹八ダ稀被蛩磉_(dá),或?yàn)榭捎没虻淖罱K耗竭。各種不同的學(xué)說(shuō)均對(duì)衰老機(jī)制進(jìn)行了深入的探討,且走上了將上述理論相融合的時(shí)代,即將研
5、究集中在環(huán)境因子傷害造成的衰老的遺傳程序改變的相關(guān)范圍之內(nèi)。
隨著年齡的增長(zhǎng),血管壁部分細(xì)胞衰老,其內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生形態(tài)與功能的改變,具體為細(xì)胞肥大扁平,內(nèi)源性一氧化氮分泌減少,呈現(xiàn)出促炎與促栓的表型,其結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生重大變化,包括血管僵硬度增加,血管壁增厚,血管腔擴(kuò)大,以及血管舒張功能減弱,這些變化改變了各種心腦血管疾病的病理生理機(jī)制,這可能是多種增齡相關(guān)性疾病,包括主動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成
6、的共同機(jī)制之一。
睪酮是一種類固醇激素,男性體內(nèi)主要的雄激素,屬于一種合成激素,也是一種激素原。有研究表明,隨著年齡的增長(zhǎng),男性50歲后體內(nèi)總睪酮及生物活性睪酮水平逐漸出現(xiàn)明顯下降。多項(xiàng)國(guó)內(nèi)外研究表明性激素失衡是引起衰老的重要因素之一,因?yàn)椴G酮有改善老年人的認(rèn)知能力、調(diào)整人體脂肪肌肉的比例,增加肌肉力量,改善運(yùn)動(dòng)能力,減少胰島素抵抗,抑制血脂異常增加,改善性功能的作用等,故睪酮是否可以延緩衰老值得進(jìn)一步研究。研究表明老年男
7、性血漿睪酮水平與多種增齡相關(guān)性疾病發(fā)病率相關(guān),即在一定范圍內(nèi),隨著睪酮水平下降,增齡性疾病的發(fā)病率上升。研究表明,一定濃度的睪酮可通過(guò)減弱VCAM-1等多個(gè)途徑來(lái)抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用,雄激素還具有改善認(rèn)知能力、炎癥反應(yīng)、抗凋亡作用、抗氧化系統(tǒng)等作用。我們的上一個(gè)課題中研究表明,睪酮在體外干預(yù)血管內(nèi)皮細(xì)胞可抑制過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老,也系統(tǒng)證明了性激素失衡參與和誘發(fā)了衰老的發(fā)生與發(fā)展,適當(dāng)調(diào)節(jié)性激素平衡有助于延緩衰老。但睪酮能否改善或
8、延緩主動(dòng)脈衰老進(jìn)程,尚需進(jìn)一步研究。為明確睪酮在干預(yù)主動(dòng)脈衰老進(jìn)程中的作用,期望其能為增齡相關(guān)脈管系統(tǒng)疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。
本研究以目前公認(rèn)的衰老標(biāo)志物:(1)小鼠主動(dòng)脈組織中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)以及丙二醛(Maleic Dialdehyde,MDA)的含量。(2)小鼠主動(dòng)脈線粒體DNA(mtDNA)缺失突變的突變率。從機(jī)體能量代謝的線粒體著手,從DNA分子水平來(lái)探討抗衰
9、老的方法,具有重要的意義。(3)其組織中去磷酸化Rb蛋白表達(dá)的量旨在探討生理劑量的外源性睪酮對(duì)去勢(shì)小鼠主動(dòng)脈衰老進(jìn)程的影響。
方法:
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組32只C57BL/6J雄性小鼠,其中24只為8周齡,隨機(jī)取16只去勢(shì),另取8只為18月齡自然衰老C57BL/6J雄小鼠。分組如下:正常組(n=8),去勢(shì)組(n=8),去勢(shì)+生理劑量的丙酸睪酮(T)組(n=8),自然衰老組(n=8)。
2.制作去勢(shì)
10、小鼠模型:隨機(jī)選取16只8周齡的C57BL/J6J小鼠切除睪丸并縫合陰囊。
3.血清睪酮濃度的檢測(cè):用ELISA試劑盒檢測(cè)雄性小鼠血清睪酮水平。
4.MDA及SOD濃度的檢測(cè):MDA采用硫代巴比妥酸法,SOD采用Oyanagui的亞硝酸鹽形成法。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書操作。
5.各組小鼠主動(dòng)脈線粒體DNA缺失突變的突變率檢測(cè):
提取線粒體DNA,嚴(yán)格按申能博彩公司全基因組DNA提取試劑
11、盒說(shuō)明書提取基因組DNA。巢氏PCR以及普通PCR引物設(shè)計(jì)及合成,巢氏PCR以及普通PCR擴(kuò)增相應(yīng)主動(dòng)脈mtDNA片段。瓊脂糖電泳鑒定PCR產(chǎn)物以及凝膠分析系統(tǒng)掃描結(jié)果并分析突變率。純化PCR產(chǎn)物并送鑒定。
6.Westem-blot法檢測(cè)磷酸化Rb蛋白表達(dá):提取小鼠主動(dòng)脈組織的組織總蛋白,BCA測(cè)量蛋白濃度。
7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)來(lái)表示,應(yīng)用spss13.0標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)軟件,各組
12、間采用單因素方差分析(One—Way ANOVA),線性關(guān)聯(lián)性分析采用線性趨勢(shì)檢驗(yàn)。p<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.各組小鼠血清睪酮水平與正常組相比較,去勢(shì)組與自然衰老組小鼠血清睪酮水平均顯著降低(P=0.000),且正常組與去勢(shì)+生理量睪酮組之間、去勢(shì)組與自然衰老組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,注射外源性睪酮后,去勢(shì)小鼠血清睪酮水平均恢復(fù)到正常水平。
2.各組小鼠主動(dòng)脈組織MDA含量、SOD活
13、性的比較與正常組小鼠比較,衰老組、去勢(shì)組主動(dòng)脈組織中MDA含量升高,SOD活性降低(P均為0.000);而給予生理劑量的睪酮3個(gè)月后,MDA含量、SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與衰老組比較,去勢(shì)+T組小鼠主動(dòng)脈組織中MDA含量降低,SOD活性增高(P均為0.000);去勢(shì)組主動(dòng)脈組織中MDA含量以及SOD活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.575和0.226)。
3.PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果四組C57 BL
14、/6J小鼠主動(dòng)脈線粒體DNA均擴(kuò)增出4549bp的未突變條帶,也均可見(jiàn)916bp、851bp的缺失片段。自然衰老組及去勢(shì)組可見(jiàn)476bp片段和304bp,去勢(shì)+T組尚可見(jiàn)304bp。與正常組小鼠主動(dòng)脈mtDNA突變率相比,去勢(shì)組與自然衰老組突變率明顯增加(P=0.000),且正常組與去勢(shì)+T組、自然衰老組與去勢(shì)組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其P值分別為0.220、0.221。即補(bǔ)充外源性丙酸睪酮后,去勢(shì)小鼠主動(dòng)脈mtDNA突變率明顯降低(
15、P=0.000)。其中睪酮濃度與小鼠主動(dòng)脈mtDNA缺失突變率相關(guān)系數(shù)為0.720。PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果,用巢氏PCR第二輪所用到的引物F3、F4用于檢測(cè)缺失型mtDNA片段的序列,該過(guò)程是由上海英駿生物工程有限公司(廣州分公司)檢測(cè),證明衰老和去勢(shì)小鼠存在3713、3864、4236、4415的缺失突變,其共同特點(diǎn)是前后均有各自相似的兩段序列。
4.各組小鼠主動(dòng)脈組織去磷酸化Rb蛋白表達(dá)比較與正常組小鼠比較,去勢(shì)組小鼠心肌
16、組織去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量增加(P=0.001);給予生理劑量睪酮干預(yù)3個(gè)月后主動(dòng)脈組織去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量較去勢(shì)組減少(P=0.001),與正常組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.873);自然衰老組小鼠心肌組織去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量增加(P=0.000)。與自然衰老組小鼠相比,去勢(shì)組小鼠主動(dòng)脈組織去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.410),去勢(shì)+T組去磷酸化Rb蛋白表達(dá)量減少(P=0.000)。
結(jié)論:
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