生理劑量睪酮對(duì)小鼠行為學(xué)及血管炎癥反應(yīng)的干預(yù)研究.pdf

1、據(jù)2000年11月第五次人口普查表明我國(guó)65歲以上老年人口已達(dá)8811萬(wàn)人,占總?cè)丝?.96％,60歲以上人口達(dá)1.3億,占總?cè)丝诘?0.2％,按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)衡量,我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入老年化社會(huì)。我國(guó)老齡化速度不僅快于全國(guó)總?cè)丝谠鲩L(zhǎng)速度、快于世界老齡化速度,而且快于經(jīng)濟(jì)發(fā)展速度,呈現(xiàn)了“未富先老”的特征。重視老年化疾病,針對(duì)老年化疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制及其干預(yù)的研究對(duì)個(gè)人及社會(huì)經(jīng)濟(jì)和結(jié)構(gòu)都有重要的意義。眾多的流行病學(xué)研究均發(fā)現(xiàn),女性的平均壽命長(zhǎng)于男

2、性。老年化疾病,如老年癡呆癥、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等疾病的發(fā)生率在兩性之中存在較大差異。此外,以女性為例,女性在絕經(jīng)期前后的健康狀況及眾多疾病的發(fā)生發(fā)展也有顯著的不同。這表明雌、雄激素的不同、性激素水平的不同都可能對(duì)人老化進(jìn)程產(chǎn)生不同的影響。
　　 在雄性激素對(duì)衰老及心血管疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程的相關(guān)研究中,已有眾多研究較為一致的表明體內(nèi)雄激素分泌水平明顯下降的老年人,以及長(zhǎng)期體內(nèi)雄激素水平過(guò)高的內(nèi)分泌疾病患者均表現(xiàn)出顯著的病

3、態(tài),而生理劑量雄激素相關(guān)的研究卻存在眾多分歧,其一個(gè)重要的因?yàn)榫驮谟谛奂に赜兄罅康?且生理效應(yīng)差別甚大的下游產(chǎn)物。所以,本研究著重于生理劑量睪酮及其核受體途徑展開(kāi)討論。
　　 腦老化是衰老的主要方面之一,可表現(xiàn)為活動(dòng)能力、學(xué)習(xí)記憶能力等方面的下降。在利用嚙齒類動(dòng)物進(jìn)行的性激素與大腦功能關(guān)系的研究表明兩者之間存在顯著相關(guān),但結(jié)論尚不一致。性激素在體內(nèi)眾多的具有生理活性的下游代謝產(chǎn)物造成了研究的復(fù)雜性。有研究表明大腦的雄性化發(fā)育與

4、體內(nèi)睪酮(T)水平顯著相關(guān),其中一些實(shí)驗(yàn)顯示這種雄性化發(fā)育是通過(guò)T芳香化代謝為雌二醇(E2)后再通過(guò)雌激素受體(ER)而產(chǎn)生的。但如果大腦的雄性化特征是最終由T轉(zhuǎn)化為E2通過(guò)ER實(shí)現(xiàn)的,那么在評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物大腦功能的實(shí)驗(yàn)中雄、雌鼠的表現(xiàn)應(yīng)該相近,但在水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,雄鼠、雌鼠的行為學(xué)結(jié)果差異甚大,而很多后續(xù)的研究表明雄鼠大腦的雄性化形成是不會(huì)被芳香化為E2,且與AR親和性更高的雙氫睪酮(DHT)的作用結(jié)果,并且是通過(guò)雄激素受體(A

5、R)實(shí)現(xiàn)的。
　　 在證明工具有血管炎癥保護(hù)效應(yīng)的眾多文獻(xiàn)中,分歧在于T的這種保護(hù)效應(yīng)是否是通過(guò)轉(zhuǎn)化為E2來(lái)實(shí)現(xiàn)的,不少實(shí)驗(yàn)采用不會(huì)轉(zhuǎn)化為E2的DHT,證明T的保護(hù)效應(yīng)并非通過(guò)E2實(shí)現(xiàn),但也有很多文獻(xiàn)顯示ER異常的男性患者與內(nèi)皮功能紊亂有關(guān),動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種血管炎性疾病,內(nèi)皮功能的紊亂是AS炎癥的起始點(diǎn),所以這些文獻(xiàn)仍能提示T轉(zhuǎn)化為雌激素后對(duì)血管的炎性反應(yīng)起著重要作用。
　　 在各種炎癥反應(yīng)中,前列腺素E2(P

6、GE2)、一氧化氮(NO)是內(nèi)毒素血癥和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)分子,可擴(kuò)張血管,升高組胺水平,增加血管壁通透性,促進(jìn)炎癥滲出,加重炎癥反應(yīng)。尤其是在炎癥發(fā)生早期炎癥細(xì)胞遷移到炎癥部位的過(guò)程中。在炎癥發(fā)生過(guò)程中,可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用,造成血流動(dòng)力學(xué)改變和器官損傷;也可直接誘導(dǎo)靶器官中細(xì)胞凋亡,引起器官功能衰竭。在我們的實(shí)驗(yàn)中,以PGE2、NO為評(píng)價(jià)炎癥的指標(biāo)。
　　 本實(shí)驗(yàn)中采用的睪丸女性化(tfm)小鼠是一種由基

7、因突變導(dǎo)致不能表達(dá)正常活性的AR的小鼠,其體內(nèi)T水平只有正常小鼠的10％-20％,而且睪丸不能正常發(fā)育,其外生殖器表現(xiàn)與雌鼠相同,所以tfm小鼠是一種觀察經(jīng)典AR功能的理想動(dòng)物模型。本研究的目的在于采用tfm小鼠觀察在AR缺乏的情況下大腦功能會(huì)發(fā)生何種變化,以及在予以內(nèi)毒素(LPS)刺激的情況下,觀各組之間血管對(duì)炎癥刺激物反應(yīng)的不同,來(lái)判斷經(jīng)典的AR途徑所發(fā)揮的作用。
　　 D半乳糖(D-gal)是我國(guó)最常用的一種衰老模型制作藥

8、物,D-gal在體內(nèi)被還原成半乳糖醇后不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi),影響滲透壓導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,代謝紊亂,氧自由基等水平增加。這一過(guò)程類似于機(jī)體衰老過(guò)程,故多用于衰老模型的制作。本實(shí)驗(yàn)用D-gal制成亞急性衰老模型,觀察T通過(guò)AR對(duì)小鼠的衰老程度發(fā)揮何種效應(yīng)。
　　 因此,我們進(jìn)行了以下三個(gè)方面進(jìn)行研究:
　　 一、生理劑量的T對(duì)亞急性衰老小鼠行為學(xué)的影響
　　 以目前公認(rèn)的行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo):避暗穿梭實(shí)驗(yàn)和水迷宮

9、實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠大腦學(xué)習(xí)記憶能力,并觀察大腦海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)的相應(yīng)改變。分組為正常組、去勢(shì)組、去勢(shì)+D-gal(去勢(shì)+D)組、去勢(shì)+D-gal+T(去勢(shì)+D+T)組。摘除6周齡雄性C57小鼠雙側(cè)睪丸,制作成T水平顯著下降的去勢(shì)小鼠模型,之后每天于頸背部皮下注射900mg/kg的D-gal制作成促衰老小鼠模型模擬T水平顯著下降的老年男性,促衰老小鼠模型予以頸背部皮下注射1mg/kg丙酸睪酮為干預(yù)因素。動(dòng)物模型制備3個(gè)月之后于每天上午09:

10、00-11:30之間做小鼠行為學(xué)測(cè)試,評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶能力。之后處死小鼠,取小鼠大腦海馬CA1區(qū)制作病理切片,觀察其形態(tài)學(xué)變化,并檢測(cè)各組小鼠大腦組織MDA、SOD水平的差異。
　　 結(jié)果顯示去勢(shì)及促衰老小鼠的行為學(xué)能力顯著低于正常組小鼠,海馬CA1區(qū)的細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞數(shù)量也顯著劣于正常組。而去勢(shì)+D+T組小鼠的行為學(xué)測(cè)試結(jié)果較去勢(shì)組和去勢(shì)+D組有顯著好轉(zhuǎn),大腦組織MDA、SOD水平,海馬CA1區(qū)的細(xì)胞形態(tài)、排列及細(xì)胞數(shù)量也優(yōu)于去勢(shì)

11、組和去勢(shì)+D組,并與正常組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 由此可認(rèn)為生理劑量的丙酸睪酮可以改善亞急性衰老小鼠的行為學(xué)能力,這種作用可能與大腦組織氧自由基水平的下降,CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)的改善有關(guān)。
　　 二、AR在生理劑量T對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的效應(yīng)中的作用
　　 為進(jìn)一步探討T-AR途徑在T對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力效應(yīng)中所發(fā)揮的作用,我們采用睪丸女性化(tfm)小鼠,這是一種由基因突變導(dǎo)致不能表達(dá)正常AR,且體內(nèi)T分

12、泌水平明顯下降的小鼠。我們將生理劑量T同時(shí)干預(yù)tfm小鼠和去勢(shì)C57小鼠,比較其學(xué)習(xí)記憶能力、大腦海馬CA1區(qū)Niss1染色的病理學(xué)變化,推斷AR在其中發(fā)揮的作用。我們同樣制作正常組小鼠、去勢(shì)小鼠、去勢(shì)+T組小鼠以及tfm組小鼠和tfm+T組小鼠。模型之后3個(gè)月后固定于每日上午09:00-11:30時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行各組小鼠的自主活動(dòng)能力、避暗穿梭和水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè),之后處死小鼠,取大腦海馬CA1區(qū)切片制作Niss1染色切片,比較各組小鼠海馬區(qū)

13、的形態(tài)學(xué)及細(xì)胞數(shù)量變化
　　 與第一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)相同,去勢(shì)組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力顯著低于正常組,去勢(shì)+T組則明顯好轉(zhuǎn),而tfm組小鼠和tfm+T組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)均劣于正常組,與去勢(shì)組無(wú)明顯差異,且tfm組小鼠與tfm+T組小鼠之間的各項(xiàng)指標(biāo)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 在缺乏有活性AR的情況下,即使補(bǔ)充了體內(nèi)正常水平的T也不能改善其大腦學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué),這提示T可以恢復(fù)小鼠大腦學(xué)習(xí)記憶能

14、力、增加小鼠自主活動(dòng)能力,改善海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)及增加神經(jīng)元數(shù)量的效應(yīng)是T通過(guò)經(jīng)典AR途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的
　　 三、生理劑量T通過(guò)AR途徑對(duì)小鼠血管炎癥反應(yīng)的影響
　　 在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中,血管內(nèi)的炎癥反應(yīng)屬于關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,所以在第三部分中,我們探討了生理劑量T通過(guò)AR途徑在外源性LPS刺激下對(duì)小鼠血管炎癥反應(yīng)的影響。和第二部分一樣,建立正常組、去勢(shì)組、去勢(shì)+T組、tfm組及tfm+T組小鼠。模型建立3個(gè)月后在麻醉無(wú)菌

15、操作下取出小鼠胸主動(dòng)脈并一分為二,在37℃,5％CO2濃度的孵箱內(nèi)置于DMEM中培育30min中后分別置于加或未加LPS的DMEM中孵育6小時(shí),之后再更換新的DMEM液孵育30min,并留取該DMEM液。用ELISA檢測(cè)各DMEM中PGE2的釋放量、用比色法檢測(cè)DMEM中的NO釋放量,加LPS的DMEM中的指標(biāo)水平減去相應(yīng)未加LPS的DMEM中的指標(biāo)水平,即是受LPS刺激后血管釋放入DMEM中的PGE2、NO的量。再取小0鼠腹主動(dòng)脈,用

16、生理鹽水制作成10％的組織勻漿,用MDA、SOD比色法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血管氧自由基水平。通過(guò)各組間血管炎癥因子表達(dá)水平的差異,推測(cè)生理劑量T、AR在其中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果提示去勢(shì)組小鼠的炎癥水平及氧自由基水平顯著高于正常組,而去勢(shì)+T組小鼠的炎癥水平則明顯下降,與正常組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。tfm組及tfm+T組各項(xiàng)指標(biāo)最低,其中tfm+T組的炎癥及氧自由基水平顯著低于去勢(shì)+T組。而tfm+T組血管的炎癥反應(yīng)及氧自由基則弱于tfm

17、組小鼠,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 由此提示失去生理劑量的T后小鼠血管在外源性炎癥刺激下會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的嚴(yán)重反應(yīng),在無(wú)活性AR的情況下,補(bǔ)充生理劑量T的tfm+T組小鼠血管損傷程度不僅弱于tfm,而且也弱于去勢(shì)+T組。
　　 通過(guò)本研究,我們能夠得出以下結(jié)論:
　　 1.生理劑量的T能增加小鼠自主活動(dòng)能力,有利于維持小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力,也可改善亞急性衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。這種效應(yīng)可能與降低小鼠大腦組織氧自由基、

18、改善大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、增加神經(jīng)元數(shù)量有關(guān)。
　　 2.生理劑量T對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能是通過(guò)經(jīng)典的AR發(fā)揮作用的。在不表達(dá)有活性AR的情況下,體內(nèi)T水平無(wú)論低于或達(dá)到生理水平都不能發(fā)揮這種效應(yīng)。
　　 3.生理劑量的T可以減弱外源性炎癥刺激誘發(fā)的小鼠血管炎癥反應(yīng)程度和氧自由基水平,與表達(dá)正常AR的小鼠比較,不表達(dá)有活性AR的小鼠中這種效應(yīng)更明顯。故可推測(cè)AR途徑會(huì)加重炎癥反應(yīng),丙酸睪酮減弱血管炎癥反應(yīng)