赤芍801調(diào)節(jié)血管炎癥反應(yīng)和血小板活化的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、炎癥反應(yīng)與血小板活化的相互介導(dǎo)及促進(jìn)，是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂、導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)等急性心肌缺血事件的重要病理基礎(chǔ)。調(diào)節(jié)血管炎癥反應(yīng)和血小板活化是心血管疾病防治領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)之一。環(huán)氧合酶(COX)是花生四烯酸代謝途徑合成PGs、TXs、PGI2的重要限速酶，其催化合成的活性物質(zhì)參與血管炎癥反應(yīng)和血小板活化過(guò)程。由血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放粘附分子，促使單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞向局部粘附、聚集、浸潤(rùn)，則是血管炎癥反應(yīng)的顯著特征

2、。赤芍801(PrG)是由中藥赤芍的活性成分沒(méi)食子酸經(jīng)酯化反應(yīng)而成的單體藥物，既往藥理研究表明它能對(duì)抗花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板聚集，且具有抗炎作用。 本課題分體外實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床研究三部分，分別從細(xì)胞、分子、基因、蛋白及整體水平上研究赤芍801對(duì)COX代謝通路、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附、炎癥因子、血小板活化和血栓形成的影響，并用于非ST段抬高急性冠脈綜合征的治療，為尋找新的、更為有效的通過(guò)抗炎、抗血栓形成等環(huán)節(jié)治療冠心病的藥物提供

3、新的思路和方法，并為臨床治療缺血性心臟病提供理論依據(jù)?！　∧康模貉芯砍嗌?01對(duì)環(huán)氧合酶代謝通路及血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)與多形核白細(xì)胞(Polymorphonuclearleukocyte,PMN)粘附的影響。 方法：采用基于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的COX-1和COX-2體外篩選模型，用鈣離子導(dǎo)入劑(CalciumionophoreA23187)短時(shí)刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，放免法(RIA)測(cè)定培養(yǎng)上清液中的6-酮-前列腺素F1α(6-

4、keto-PGF1α)的量反映COX-1活性；用脂多糖(lipopolysac-charide，LPS)長(zhǎng)時(shí)間刺激細(xì)胞，測(cè)定培養(yǎng)上清液中的前列腺素E2(PGE2)的量反映COX-2活性。半定量RT-PCR法檢測(cè)PrG對(duì)LPS刺激的Raw小鼠巨噬細(xì)胞COX-1、COX-2mRNA表達(dá)的影響。Westernblotting法檢測(cè)PrG對(duì)LPS刺激的Raw小鼠巨噬細(xì)胞COX-1、COX-2蛋白表達(dá)的影響。同時(shí)以TNF-α為刺激物，造成人內(nèi)皮細(xì)

5、胞炎癥模型。孟加拉玫瑰紅活細(xì)胞染色法測(cè)定PMN與VEC黏附率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1、E-selectin表達(dá)。 結(jié)果：PrG體外1×10-5、5×10-6mol·L-1濃度下不影響6-keto-PGF1α生成(P＞0.05)，而在1×10-6至5×10-8mol·L-1濃度下則誘導(dǎo)6-keto-PGF1α生成(P＜0.001)，并呈較好的劑量依賴性。PrG體外1×10-5mol·L-1、1×10-6mol·L-

6、1可抑制PGE2生成(P＜0.05)。PrG(0.001mM-5mM)可不同程度抑制內(nèi)皮細(xì)胞與PMN的粘附，PrG在5mM、2mM、1mM濃度下可不同程度地抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達(dá)，呈劑量依賴性。較低濃度PrG(100uM-1uM)對(duì)HUVEC表面ICAM-1表達(dá)無(wú)明顯影響，對(duì)HUVEC表面E-selectin表達(dá)略有增加的趨勢(shì)(但P＞0.05)。10mMASA對(duì)HUVEC表面ICAM-1、E-selec

7、tin陽(yáng)性表達(dá)率無(wú)明顯影響(P＞0.05)。 結(jié)論：在1×10-5到5×10-8mol·L-1濃度范圍內(nèi)，PrG低濃度時(shí)激活COX-1，高濃度時(shí)抑制COX-2，但不影響COX-1、COX-2mRNA表達(dá)；PrG可抑制COX-2蛋白表達(dá)，但對(duì)COX-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。高濃度PrG(0.1-1mM)是有效的人PMN與HUVEC粘附的抑制劑，作用機(jī)理可能與抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達(dá)有關(guān)，其有效作用濃度

8、低于ASA。　　目的：觀察赤芍801對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈血栓形成模型血栓形成時(shí)間及凝血和纖溶系統(tǒng)的影響。 方法：SD大鼠隨機(jī)分為4組：生理鹽水對(duì)照組、肝素組(1250IU/Kg靜脈注射)、PrG小劑量組(30mg/Kg靜脈注射)、PrG大劑量組(60mg/Kg靜脈注射)，各組均于電刺激前30min給藥。直流電連續(xù)刺激頸總動(dòng)脈造成大鼠頸動(dòng)脈血栓形成模型，記錄自通電刺激至頸總動(dòng)脈溫度突降時(shí)間，作為血栓形成時(shí)間，ELISA法測(cè)定血漿組

9、織纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)水平。 結(jié)果：PrG30mg/Kg、60mg/Kg均可延長(zhǎng)大鼠動(dòng)脈血栓形成時(shí)間，但明顯弱于肝素(P＜0.05)。PrG30mg/Kg、60mg/Kg與生理鹽水對(duì)照組相比，有升高t-PA/PAI的作用趨勢(shì)，但P＞0.05。 結(jié)論：PrG有一定的抗大鼠實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈血栓形成的作用，并可輕度調(diào)節(jié)血漿t-PA/PAI比值失衡?！　∧康模河^察赤芍801對(duì)急性心肌梗

10、死大鼠血清炎性因子及缺血心肌COX-2、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響。 方法：結(jié)扎冠脈左前降支造成造成大鼠急性心肌梗死模型，以標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖ST段弓背抬高示AMI形成。大鼠隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組(又分梗死后24h，3d，7d三個(gè)亞組)、赤芍801大劑量組(80mg·kg-1·d-1ip)、赤芍801小劑量組(40mg·kg-1·d-1ip)、阿斯匹林對(duì)照組(25mg·kg-1·d-1ig)，共給藥7天。放免

11、法檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α含量，免疫組化法檢測(cè)心肌組織COX-2、ICAM-1表達(dá)。 結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組TNF-α水平明顯升高，但I(xiàn)L-1β水平升高無(wú)顯著差異。模型組缺血區(qū)心肌組織COX-2、ICAM-1表達(dá)于24小時(shí)開(kāi)始升高，7天時(shí)達(dá)最高峰。與模型組相比，赤芍801小劑量組可降低血清TNF-α水平，輕度抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達(dá)。 結(jié)論：赤芍801小劑量組可減輕急性心肌梗死大鼠炎癥因子

12、TNF-α水平，輕度抑制缺血心肌組織COX-2、ICAM-1表達(dá)?！　∧康模河^察注射用赤芍801聯(lián)合西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)藥物治療對(duì)非ST段抬高急性冠脈綜合征患者的療效及血清炎癥標(biāo)志物和血小板活化的影響。 方法：選擇符合入選標(biāo)準(zhǔn)的UA/NSTMI患者55例，在西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)藥物治療的基礎(chǔ)上，隨機(jī)分為注射用赤芍801治療組(27例)和注射用丹參對(duì)照組(28例)，均連續(xù)用藥14天。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者治療前后血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb-Ⅲa受體，C

13、D62P受體表達(dá)陽(yáng)性率及平均熒光強(qiáng)度(MFI)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)患者治療前后血中炎癥標(biāo)志物高敏C反應(yīng)蛋白(Hs-CRP)水平。 結(jié)果：兩組心絞痛有效率和心電圖有效率無(wú)顯著差異，兩組治療后血清Hs-CRP水平、GPⅡb-ⅢaMFI、CD62P陽(yáng)性率均較治療前明顯降低(P＜0.05)，赤芍801組與丹參對(duì)照組比較，有進(jìn)一步降低血清Hs-CRP水平及GPⅡb-ⅢaMFI的趨勢(shì)，但差別無(wú)顯著意義。 結(jié)論：在西醫(yī)標(biāo)

14、準(zhǔn)藥物治療的基礎(chǔ)上加用注射用赤芍801或丹參粉針兩組療效及對(duì)血清炎癥標(biāo)志物Hs-CRP和血小板活化的影響無(wú)顯著差異。與丹參對(duì)照組比較，赤芍801組有進(jìn)一步降低血清Hs-CRP水平及GPⅡb-ⅢaMFI的作用趨勢(shì)。　　綜上所述，本研究在既往推測(cè)PrG作用環(huán)節(jié)可能是在環(huán)氧酶的基礎(chǔ)上，建立了分別基于小鼠巨噬細(xì)胞和人內(nèi)皮細(xì)胞的兩種體外COX-1和COX-2抑制劑篩選模型，證明了PrG是COX-2活性水平和蛋白表達(dá)水平的抑制劑，但低濃度(＜1μ

15、M)對(duì)COX-1活性呈促進(jìn)作用。通過(guò)建立內(nèi)皮細(xì)胞炎癥模型，證明高濃度PrG(＞0.1mM)是有效的人PMN與HUVEC粘附的抑制劑，作用機(jī)理可能與高濃度時(shí)抑制HUVEC表面ICAM-1、E-selectin表達(dá)有關(guān)，其有效作用濃度低于ASA。并通過(guò)建立大鼠實(shí)驗(yàn)性頸動(dòng)脈血栓形成模型和急性心肌梗死模型，在體內(nèi)驗(yàn)證了PrG具有一定的抗血栓形成、減輕炎癥因子TNF-α釋放和抑制缺血心肌COX-2表達(dá)的作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)藥物治療的基