小劑量雌激素對癲癇大鼠行為學(xué)、海馬神經(jīng)元損傷及炎癥相關(guān)作用研究.pdf

1、雌激素在諸多急慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本課題組前期在海人酸(kanic acid，KA)尾靜脈注射癲癇模型中觀察到苯甲酸雌二醇(EB)干預(yù)可減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)后海馬CA1、CA3和門區(qū)(hilus區(qū))神經(jīng)元缺失，這在其他癲癇模型中也得到了證實(shí)。雌激素神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制目前認(rèn)為主要包括神經(jīng)營養(yǎng)作用、抗凋亡作用和抗炎作用。在癲癇中研究最多的是雌激素的神經(jīng)營養(yǎng)作用，對其抗炎作用研究甚

2、少，而免疫炎癥機(jī)制在癲癇中的作用越來越受重視。
　　化學(xué)致癇劑、電刺激等多種癲癇模型中均可觀察到癲癇發(fā)作后快速誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，主要包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、經(jīng)典的炎性細(xì)胞因子如IL-1B、TNF-α、IL-6表達(dá)增加，同時伴隨下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)(TLR、NF-κB、補(bǔ)體、趨化因子、CRP等)產(chǎn)生。炎癥反應(yīng)在一定程度上促進(jìn)了癲癇發(fā)作病理生理進(jìn)程，并可導(dǎo)致癲癇相關(guān)的海馬病理性改變，如神經(jīng)元死亡和再生、膠質(zhì)細(xì)胞再生、苔蘚纖維發(fā)芽等

3、。
　　雌激素在腦外傷、卒中、神經(jīng)變性疾病體內(nèi)外研究中均觀察到可通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由于大劑量雌激素副作用多，而目前關(guān)于大小劑量尚無明確界定，一般認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)選用的10μg/rat為小劑量雌激素，所以本課題旨在研究小劑量EB在匹羅卡品癲癇模型中對海馬神經(jīng)元損傷的影響及炎癥反應(yīng)在其中的作用，并對雌激素作用的受體機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　第一部分小劑量雌激素對去勢雌性大鼠癲癇行為學(xué)及海馬神經(jīng)元損傷影響
　　目的：

4、觀察小劑量EB預(yù)處理對去勢雌性大鼠癲癇行為學(xué)及海馬神經(jīng)元損傷的影響。
　　方法：成年雌性SD大鼠陰道涂片確定有2個正常生理周期后行雙側(cè)卵巢摘除，術(shù)后飼養(yǎng)1w，第8d隨機(jī)分成對照組(Control組)、致癇組(Pilocarpine組)、雌激素干預(yù)組(EB組)、雌激素干預(yù)后致癇組(Pilo+EB組)。根據(jù)不同分組分別給予10μg/0.1ml EB或0.1ml芝麻油皮下注射連續(xù)4d。末次給藥后6h進(jìn)行匹羅卡品(320mg/kg，i.p

5、.)致癇或等量生理鹽水腹腔注射。記錄癲癇發(fā)作潛伏期、重型發(fā)作潛伏期、死亡率，SE后8h、24h處死，心臟采血2ml離心取血清，大鼠灌注取腦制備冰凍切片。電化學(xué)發(fā)光法檢測SE后24h各組血清雌二醇(E2)濃度以監(jiān)測體內(nèi)雌激素狀態(tài)。尼氏染色觀察癲癇后不同時間點(diǎn)海馬CA1、CA3、hilus區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及分布情況，F(xiàn)luoro-Jade B(FJB)染色和NeuN免疫熒光染色分別評估神經(jīng)元變性和存活情況。
　　結(jié)果：1、本實(shí)驗(yàn)部分致癇大

6、鼠35只，4只大鼠致癇失敗，余大鼠均達(dá)4/5級反復(fù)發(fā)作(SE)。小劑量EB干預(yù)后大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期和重型發(fā)作潛伏期縮短，SE后8h、24h存活率增加，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、SE后24h外周血E2濃度檢測顯示EB干預(yù)可導(dǎo)致血E2濃度明顯升高(與Control組相比，P<0.01)，約為動情前期E2水平(122.8±9.19pmol/L)的2.5倍，癇性發(fā)作對血E2濃度無明顯影響。3、尼氏染色顯示致癇后8h組海馬各亞區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊

7、，結(jié)構(gòu)完整，與未致癇組相比胞體略小，胞漿中央淡染區(qū)不明顯。致癇后24h組海馬CA1、CA3和hilus區(qū)均可見胞膜破裂、尼氏小體外露等。4、FJB染色顯示未致癇組和致癇8h組染色陰性，致癇后24h組則表現(xiàn)為FJB陽性染色。小劑量EB干預(yù)可導(dǎo)致SE后24h海馬hilus區(qū)FJB陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，對CA1、CA3區(qū)無明顯作用。5、SE后8h海馬各亞區(qū)NeuN陽性細(xì)胞較對照組無明顯減少，SE后24h，Pilocarpine組海

8、馬各亞區(qū)及Pilo+EB組CA1和CA3區(qū)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)分別較Control組和EB組少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中Pilocarpine組海馬hilus區(qū)NeuN陽性細(xì)胞較Pilo+EB組明顯減少(P<0.01)。
　　結(jié)論：小劑量EB(10μg/rat)皮下注射連用4天，可使血清E2水平持續(xù)(>30h)維持在動情前期水平2.5～3倍之上，癲癇發(fā)作本身對大鼠血清E2水平無顯著影響；小劑量EB對匹羅卡品癲癇發(fā)作潛伏期及重型發(fā)作潛伏期

9、無明顯影響，僅在一定程度減少SE后死亡率，但差異尚無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；匹羅卡品誘導(dǎo)的SE持續(xù)1h即可引起海馬各亞區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性變性(SE后24h)，小劑量EB預(yù)處理可明顯減少SE后海馬hilus區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)性死亡。
　　第二部分小劑量雌激素對去勢雌性大鼠癲癇發(fā)作后海馬炎癥反應(yīng)影響
　　目的：觀察小劑量EB干預(yù)在雌性去勢大鼠癲癇發(fā)作后海馬炎癥反應(yīng)中的作用。
　　方法：參考第一部分制備動物模型，SE后8h、24h處死心臟采血

10、、完整剝離海馬組織。全血離心取血清，選右側(cè)海馬組織加0.01MPBS勻漿取上清液。酶聯(lián)免疫吸附法測定血清和海馬勻漿上清液中IL-1β和TNF-α含量。另取第一部分腦片行CD11b和GFAP免疫熒光染色，觀察腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量變化，比較各組間膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　結(jié)果：1、匹羅卡品致癇可導(dǎo)致大鼠海馬組織IL-1β和TNF-α含量增高，SE后8h明顯，24h恢復(fù)至對照組水平，SE后8h Pilocarpine組海

11、馬IL-1β和TNF-α水平分別為對照組的226％、261％。小劑量EB可明顯下調(diào)SE后8h海馬組織IL-1β表達(dá)，對TNF-α表達(dá)作用不明顯。
　　2、匹羅卡品導(dǎo)致的癇性發(fā)作及小劑量EB干預(yù)對外周血IL-1β和TNF-α表達(dá)無明顯影響。3、癲癇發(fā)作可誘導(dǎo)腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，SE后8h即可觀察到，SE后24h更為明顯，表現(xiàn)為胞體變大，分枝變粗，小膠質(zhì)細(xì)胞完全活化后呈現(xiàn)出“阿米巴樣”。小劑量EB干預(yù)可減少SE后8h、2

12、4h海馬hilus區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，對CA1、CA3區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化無明顯作用。SE后24h海馬CA3區(qū)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Pilo+EB組明顯減少(與Pilocarpine組相比，P<0.05)，CA1、hilus區(qū)兩組間無明顯差異(P>0.05)；SE后8h兩組海馬各亞區(qū)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)均無明顯差異。
　　結(jié)論：癲癇發(fā)作可引起腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化、IL-1β和TNF-α表達(dá)增加，對外周血IL-1β和TNF-α表達(dá)無明顯影響。小劑

13、量EB干預(yù)可減少SE后海馬IL-1β表達(dá)、海馬hilus區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。本部分研究提示小劑量EB干預(yù)可以抑制匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇大鼠海馬炎癥反應(yīng)。
　　第三部分小劑量雌激素對去勢雌性大鼠癲癇發(fā)作后海馬雌激素受體表達(dá)影響
　　目的：觀察小劑量EB干預(yù)對去勢雌性大鼠致癇后海馬雌激素受體表達(dá)的影響。
　　方法：選用第二部分實(shí)驗(yàn)中留取的左側(cè)海馬，加細(xì)胞總蛋白提取液，勻漿取上清液，免疫印跡法檢測上清液

14、中ERα和ERβ表達(dá)。
　　結(jié)果：1、SE后8h，Pilocarpine組和Control組相比ERα表達(dá)相似，小劑量EB干預(yù)后ERα表達(dá)有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SE后24h，各組大鼠海馬勻漿ERα表達(dá)仍無明顯差異。匹羅卡品導(dǎo)致的癇性發(fā)作和小劑量EB干預(yù)對SE后8h、24h海馬ERα表達(dá)均無明顯影響。2、SE后8h，Pilocarpine組海馬ERβ表達(dá)較對照組有降低趨勢，小劑量EB干預(yù)后ERβ降低更為明顯，但各組之間差異尚

15、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SE后24h，Pilo+EB組海馬勻漿ERβ表達(dá)較EB組和Pilocarpine組明顯降低(P值分別<0.01和<0.05)，余組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：匹羅卡品導(dǎo)致的癇性發(fā)作和小劑量EB干預(yù)對SE后8h、24h海馬ERα表達(dá)均無顯著影響，對SE后8h海馬ERβ表達(dá)也無明顯影響。小劑量EB干預(yù)對SE后24h未致癇鼠海馬ERβ表達(dá)無顯著作用，但可明顯降低致癇鼠海馬ERβ表達(dá)。
　　1.小劑量EB(10μg

16、/rat)連用4d可使末次給藥后的30h內(nèi)去勢大鼠體內(nèi)E2水平持續(xù)維持在動情前期水平2.5倍之上，癲癇發(fā)作對血清E2濃度無顯著影響；
　　2.小劑量EB干預(yù)對匹羅卡品癲癇模型行為學(xué)改變(潛伏期、死亡率等)無明顯影響，但可減少SE后24h海馬hilus區(qū)神經(jīng)元缺失；
　　3.癲癇發(fā)作可導(dǎo)致海馬內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活化，IL-1β和TNF-α炎性細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，對外周血IL-1β和TNF-α表達(dá)無明顯影響。小劑量EB干預(yù)可明顯減少海馬h