膽固醇對(duì)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Aβ產(chǎn)生的影響及雌激素的可能作用.pdf

1、老年性癡呆又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性變疾病，以記憶丟失和認(rèn)知功能障礙為典型臨床表現(xiàn)。其病因目前尚不清楚，大多認(rèn)為是一種多病因疾病。近幾年許多研究者從各個(gè)不同的角度如淀粉樣蛋白沉積、雌激素改變、炎癥介質(zhì)、免疫因素、膽固醇因素等探討AD的病因病理機(jī)制和治療手段，提出了多種假說。其中膽固醇過載假說和雌激素缺乏假說的尤為引人注目。前者認(rèn)為，膽固醇與淀粉樣前體蛋白(amylo

2、id precursor protein，APP)的降解密切相關(guān)，在Aβ的產(chǎn)生和異常沉積過程中具有重要調(diào)節(jié)作用，膽固醇過載會(huì)導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生增多和過度聚集，引發(fā)老年斑的產(chǎn)生。后者指出，雌激素缺乏可能與AD的發(fā)病有關(guān)。流行病學(xué)證實(shí)，女性絕經(jīng)后AD患者多于男性，約為1.5～3：1，而雌激素替代療法(estrogen replacement therapy,ERT)可以降低AD的發(fā)病率。雌激素可以通過多種機(jī)制對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用，同時(shí)，雌

3、激素還可以影響脂質(zhì)代謝的酶類，發(fā)揮降膽固醇的作用，ERT治療高脂血癥的效果甚至優(yōu)于單用降脂藥物。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，他汀類降脂藥物對(duì)AD具有治療作用。由此可以推斷，雌激素和他汀類對(duì)AD的治療作用與膽固醇的代謝可能有一定程度的關(guān)聯(lián)。 目的：本課題以體外培養(yǎng)的SD胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察膽固醇對(duì)神經(jīng)元Aβ產(chǎn)生的影響，探討膽固醇在AD病理發(fā)病機(jī)制中的作用。同時(shí)以具有明確降膽固醇作用的洛伐他汀組為對(duì)照，揭示雌激素對(duì)抗膽固醇損傷作用的可能

4、機(jī)制，探討其是否具有體外降膽固醇作用，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。方法：SD胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)，接種于96孔和6孔培養(yǎng)板內(nèi)。隨機(jī)法分為5組： (1)膽固醇組：神經(jīng)元體外生長(zhǎng)7d后，培養(yǎng)液內(nèi)加入膽固醇(8μg/ml)，持續(xù)作用2d、5d； (2)雌激素+膽固醇組：神經(jīng)元體外生長(zhǎng)5d后加入17β-雌二醇(10ng/ml，無水乙醇溶解)，作用2d后換含有膽固醇(8μg/ml)的培養(yǎng)液，持續(xù)作用2d、5d；

5、(3)雌激素組：神經(jīng)元體外生長(zhǎng)5d后，培養(yǎng)液內(nèi)加入17β-雌二醇(10ng/ml，無水乙醇溶解)，持續(xù)作用4d、7d； (4)洛伐他汀組：神經(jīng)元體外生長(zhǎng)5d后，培養(yǎng)液內(nèi)加入洛伐他汀(4μmol/L，無水乙醇溶解)，持續(xù)作用4d、7d； (5)正常對(duì)照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)持續(xù)培養(yǎng)9d、12d。 各組細(xì)胞培養(yǎng)9d、12d后終止培養(yǎng)，分別用MTT檢測(cè)各細(xì)胞存活數(shù)量和活力、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的線粒體膜電位(△ψm)變化、

6、雙抗體夾心法Elisa檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)的Aβ40的含量、RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)APP、BACE1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所得數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，利用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料多組均數(shù)比較采用方差分析。 結(jié)果： 1.本實(shí)驗(yàn)建立了SD胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)好，培養(yǎng)至7d時(shí)鑒定顯示，神經(jīng)元比例為90％±4.6％，神經(jīng)元細(xì)胞純度高，符合實(shí)驗(yàn)要求。

7、 2.不同干預(yù)條件下，生長(zhǎng)9d的各組細(xì)胞MTT檢測(cè)，各組A值分別為：膽固醇組0.719±0.033；雌激素+膽固醇組0.737±0.055；洛伐他汀組0.742±0.067；雌激素組0.733±0.045；正常組0.728±0.041。各組間細(xì)胞存活數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。繼續(xù)作用3d后，也即生長(zhǎng)12d時(shí)各組細(xì)胞的A值分別為：膽固醇組0.602±0.031；雌激素+膽固醇組0.727±0.040；洛伐他汀組0.725±

8、0.039；雌激素組0.721±0.085；正常組0.703±0.059。其中，膽固醇組的細(xì)胞活力明顯低于正常組，t=6.413，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而雌激素+膽固醇組與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 3.不同干預(yù)條件下各組細(xì)胞的△ψm，以膽固醇組下降最多。各組正常細(xì)胞，即發(fā)紅色高強(qiáng)度光細(xì)胞的百分率分別為：膽固醇組：74.4％±3.37％；雌激素+膽固醇組：89.5％±4.52％；正常組：91.3

9、％±5.17％。膽固醇組與正常組之間均數(shù)t檢驗(yàn)顯示，P<0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雌激素+膽固醇組與正常組比較，P>0.10，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.雙抗體夾心法Elisa檢測(cè)得知，培養(yǎng)液內(nèi)Aβ40在各組的含量分別是：膽固醇組：491.2±31.14pg/ml；雌激素組：295.8±23.13pg/ml；洛伐他汀組：244.9±22.73pg/ml；正常組：280.9±25.58pg/ml。膽固醇組培養(yǎng)液內(nèi)Aβ40含量顯著高于

10、正常對(duì)照組，兩組均數(shù)t檢驗(yàn)顯示：t=16.502，P<0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。洛伐他汀組含量低于正常組，P=0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雌激素組與正常組比較t=-1.366，P=-0.189，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同的膽固醇作用濃度下，對(duì)應(yīng)培養(yǎng)液內(nèi)Aβ40的含量為：膽固醇4μg/ml，Aβ40 321±27.18pg/ml；膽固醇8μg/ml，Aβ40491.2±31.14pg/ml；膽固醇16μg/ml，Aβ40 553±34.1

11、8pg/ml；膽固醇32μg/ml，Aβ40 562±37.46pg/ml；膽固醇64μg/ml，Aβ40 564±40.23pg/ml。膽固醇濃度較低時(shí)，Aβ40隨著膽固醇濃度的增高而增高，繼而保持在一個(gè)較高的水平。 5.各組細(xì)胞BACE1 mRNA的灰度與內(nèi)參GADPH的灰度比較，比值分別為：膽固醇組：0.779±0.065；洛伐他汀組：0.738±0.029；雌激素組：0.781±0.061；正常組：0.748±0.057

12、。多組均數(shù)方差分析顯示，P>0.05，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膽固醇、雌激素不能影響神經(jīng)元BACE-1的mRNA表達(dá)。 6.各組細(xì)胞APPmRNA的灰度與內(nèi)參GADPH的灰度比較，比值分別為：膽固醇組：1.31±0.058；洛伐他汀組：0.69±0.037；雌激素組：0.88±0.042；正常組：0.82±0.051。膽固醇組與正常對(duì)照組相比顯著增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，洛伐他汀組與正常組相比，有明顯降低，其差

13、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而雌激素組與正常組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1.實(shí)驗(yàn)濃度的膽固醇(8μg/ml)對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元具有損傷作用，可以使原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞線粒體膜電位下降，從而加速凋亡，使活細(xì)胞數(shù)量和活力明顯下降。膽固醇引起Aβ增多可能是膽固醇損傷作用的重要原因之一。而雌激素預(yù)先作用2d可以對(duì)抗膽固醇引起的神經(jīng)元損傷。 2.體外8μg/ml的膽固醇濃度可以使原代培養(yǎng)神經(jīng)元的

14、APP mRNA的表達(dá)水平顯著增高，洛伐他汀可以有效抑制這一增高趨勢(shì)，而雌激素不能抑制這一增高趨勢(shì)。雌激素和膽固醇均不能調(diào)節(jié)BACE-1 mRNA的表達(dá)水平。 3.實(shí)驗(yàn)濃度的膽固醇可使原代培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生的Aβ40顯著增多，且增多程度與膽固醇濃度呈正相關(guān)。洛伐他汀可以通過降低膽固醇的含量而使Aβ40明顯減少，而雌激素不能抑制體外Aβ40的產(chǎn)生。 4.膽固醇引起Aβ40增多可能是通過上調(diào)APP的表達(dá)，同時(shí)增加BACE-1的活