丙泊酚對發(fā)育期大鼠皮質神經(jīng)元鈣離子的影響.pdf

1、全身麻醉藥是否導致發(fā)育期中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性是近年來深受關注的熱點問題。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥物，具有起效迅速、作用時間短、蘇醒快、易控制和副作用少等優(yōu)點，廣泛應用小兒麻醉和重癥監(jiān)護室。但越來越多的在體或離體動物實驗證實，靜脈麻醉藥丙泊酚對發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用。丙泊酚對發(fā)育期大腦神經(jīng)毒性的機制目前仍然不清楚，其中一個可能的機制是引起了神經(jīng)元內鈣穩(wěn)態(tài)的絮亂。發(fā)育期神經(jīng)元有其特殊的生理特征，本研究擬通過體外培養(yǎng)的發(fā)育期神經(jīng)元，研究丙

2、泊酚對發(fā)育期皮質神經(jīng)鈣離子的影響。實驗主要分為兩部分：一，優(yōu)化和改進體外培養(yǎng)的原代發(fā)育期皮質神經(jīng)元方法，觀察和鑒定發(fā)育期神經(jīng)元，培養(yǎng)純度高、活力好的神經(jīng)元，能夠滿足下一步實驗的要求。二，激光共聚焦顯微鏡下觀察Fluo-4 AM熒光染色后發(fā)育期皮質神經(jīng)元形態(tài)學變化；檢測不同濃度的丙泊酚(10、30、100μmol/L)對大鼠發(fā)育期皮質神經(jīng)細胞內鈣離子濃度的變化，評估丙泊酚對發(fā)育期皮質神經(jīng)細胞 L-型鈣離子通道的影響。
　　第一部分新

3、生大鼠皮質神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法
　　目的：建立一種穩(wěn)定、高效、簡單可行的新生大鼠大腦皮質神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法。
　　方法：取新生24h內的SD大鼠，分離皮質，采用木瓜蛋白酶消化、實驗前多聚賴氨酸鋪板、不同機械吹打次數(shù)及細胞接種2h后全量換為添加B-27的Neurobasal A培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法，MTT比色法分析檢測神經(jīng)元細胞成活率；于不同時間在倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)；利用神經(jīng)元特異性標志物微管蛋白相關標志物2(mic

4、rotubule associated protein2,MAP2)鑒定神經(jīng)元純度。
　　結果：木瓜蛋白酶明顯增加原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞活力（P＜0.01），采用適度的機械吹打、實驗前多聚賴氨酸鋪板及細胞接種2h后全量換為添加B-27的Neurobasal A培養(yǎng)基，對神經(jīng)細胞的活力沒有明顯的影響（P>0.05）。大部分皮質神經(jīng)元具有典型的神經(jīng)元形態(tài)特征；經(jīng)MAP2免疫熒光技術鑒定神經(jīng)元神經(jīng)元所占比例達95％以上，能夠滿足進一步的實驗

5、要求。
　　結論：該方法操作簡單、高效、方便可行，結果穩(wěn)定。
　　第二部分丙泊酚對發(fā)育期大鼠皮質神經(jīng)元鈣離子的影響
　　目的：觀察不同濃度丙泊酚對大鼠發(fā)育期大腦皮質神經(jīng)元鈣離子（［Ca2+］i）的影響，檢測丙泊酚對發(fā)育期皮質神經(jīng)細胞L-型鈣離子通道的影響。
　　方法：原代培養(yǎng)7天的大鼠皮質神經(jīng)元，隨機分為4組：對照組（Control組）、丙泊酚10μmol·L-1組（P10組）、丙泊酚30μmol·L-1組（P3

6、0組）、丙泊酚100μmol·L-1組（P100組）；尼非地平干預實驗分組：對照組（Control組）、丙泊酚組（Propofol100μmol·L-1組）、尼非地平組（Nifedipine10μmol·L-1組）、丙泊酚+尼非地平組（Nifedipine(10μmol·L-1)+Propofol(100μmol·L-1)組），F(xiàn)luo-4AM鈣熒光指示劑染色,激光共聚焦顯微鏡下動態(tài)檢測基礎值、丙泊酚預處理后和氯化鉀溶液誘發(fā)細胞內鈣離子

7、濃度的變化。
　　結果：培養(yǎng)7天的大鼠各組皮質神經(jīng)元基礎值、丙泊酚預處理各組鈣熒光強度間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；丙泊酚預處理后鈣熒光強度同基礎值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；氯化鉀誘發(fā)后各組鈣熒光強度明顯高于基礎值(P<0.01)；P30、P100組與Control組比較氯化鉀誘發(fā)后鈣熒光強度峰值明顯降低(P<0.01)，分別下降了26.3%和28.6%；P30、P100與P10組比較明顯降低(P<0.01)

8、，P10組與Control組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，P100與P30組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。尼非地平干預實驗中，高鉀刺激細胞鈣熒光強隊明顯升高(P<0.01)；丙泊酚預處理后，氯化鉀誘發(fā)細胞內鈣熒光強度峰值與對照組組比較，明顯降低(P<0.01)。尼非地平預處理神經(jīng)元25min后，細胞內鈣離子熒光強度與對照組比較明顯降低(P<0.01)。尼非地平抑制高鉀導致的細胞內鈣超載與丙泊酚預處理組比較差異無統(tǒng)計學意義