糖尿病主動脈病變發(fā)病機制及藥物干預的研究.pdf

1、糖尿病是引起動脈粥樣硬化的主要原因之一，糖尿病患者比非糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥如卒中、心梗及周圍血管疾病的危險提高了2-4倍，糖尿病已經作為冠心病等危癥越來越受到人們的重視。研究表明，糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與血管病變引起的功能改變有關。糖尿病大血管病變，即在糖尿病狀態(tài)下的血管重構，是糖尿病心血管并發(fā)癥的主要病理學基礎，其發(fā)病機制尚未完全明了，有關于此的治療也需要進一步提高。 糖尿病時大血管病變彌散、廣泛，這可能是糖尿

2、病患者更易罹患動脈粥樣硬化的主要原因。研究發(fā)現，糖尿病時血管結締組織基質成分顯著改變，高糖誘導的膠原過度表達與血管壁纖維化、硬化高度相關。血管纖維化增加動脈僵硬度，引發(fā)血流紊亂，最終造成血流動力學障礙，成為動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的力學基礎。但是，高糖通過何種信號傳導途徑促進細胞外基質增多，繼而引起血管纖維化這一糖尿病靶器官損害的具體機制還不清楚。 在纖維化過程中，TGF-β對于基質蛋白聚集和膠原沉積具有重要作用。雖然TGF及其相關

3、受體涉及糖尿病等多種疾病的理論已經建立，但其介導組織纖維化的細胞內信號通路還不清楚。TGF-β信號從細胞膜傳導到細胞核由細胞內效應分子Smads介導。近年來研究發(fā)現信號蛋白Smad2/3活化在TGF-β介導的組織器官纖維化形成中起了重要的信號傳遞作用。TGF-β家族成員通過細胞表面絲氨酸/蘇氨酸受體進行信號傳導，Smads蛋白可將這種配體信號從細胞表面?zhèn)鬟f至細胞核中，與多種轉錄因子相互作用，從而影響轉錄過程。最近幾個研究證實，TGF-

4、β/Smads信號通路是心臟、腎臟、肝臟、腹膜纖維化病變的細胞內機制；而TGF-β在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中是否也通過激活Smads信號通路尚不清楚。 細胞外基質中存在的TGF-β是以無活性形式分泌的，只有轉化成為活性形式，才能與細胞表面TGF受體結合，發(fā)揮生物學效應，此活化過程受多種因素調節(jié)。TGF-β活化的控制是纖維化進程的一個潛在決定因素。凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)系血小板受凝血酶刺激后，從α-顆粒中釋放出的一種多

5、功能細胞基質糖蛋白，它與無活性的TGF-β結合后可引起后者活化。最近報道，高血糖刺激血管細胞產生TSP-1，TSP-1蛋白和mRNA在糖尿病大血管中的表達比非糖尿病血管增高。TSP-1在血管壁的高表達可能反映了糖尿病與血管病變之間的分子聯系。另據研究報道高血糖環(huán)境中RAS系統(tǒng)激活，血管緊張素II(AngII)刺激TSP-1表達，進而促進TGF-β分泌與活化。因此我們推測，高糖可能通過Ang II/TSP-1/TGF-β/Smads信號通

6、路將信息傳入細胞內，促進細胞外基質合成，引起血管重構，最終導致糖尿病大血管并發(fā)癥。此機制為AT1受體拮抗劑用于糖尿病的治療提供了理論依據。 TGF-β參與調節(jié)許多生物學過程，目前我們對其細胞分子生物學特點略知一二，但有關它們的信號傳導通路和作用機制的研究還剛剛起步。有些研究提示，AngII/TSP-1/TGF-β/Smads信號通路可能是未來治療動脈粥樣硬化和糖尿病大血管并發(fā)癥的靶目標，深入研究該信號通路的作用及其調控機制，將有

7、助于揭示糖尿病血管纖維化發(fā)生發(fā)展的病理生理過程，并為抗纖維化治療提供新的思路。 本研究立足于糖尿病心血管并發(fā)癥研究的前沿，在系統(tǒng)分析糖尿病細胞信號傳導途徑的基礎上，綜合運用分子生物學、細胞生物學、組織病理學、超聲心動圖技術和計算機圖像分析等方法，對糖尿病大鼠的主動脈形態(tài)學和超微結構進行定性觀察和定量分析，深入研究了“葡萄糖/Ang II/，FSP-1/TGF-β<,1>/Smads”信號傳導途徑(GATTS途徑)在糖尿病大血管并

8、發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中的作用，并應用AT1受體拮抗劑纈沙坦對糖尿病動物進行干預治療，尋找早期診治糖尿病血管病變的新靶點。 目的 (1) 建立2型糖尿病動物模型； (2) 觀察糖尿病動物模型主動脈組織病理學和超微結構的變化； (3) 明確血管結締組織異常在糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用； (4) 闡明“葡萄糖/AngⅡ/TSP-1/17GF-β<,1>/Smads"信號傳導途徑(GATTS途徑)

9、 在糖尿病血管病變中的作用； (5) 評價纈沙坦在防治糖尿病血管病變發(fā)生發(fā)展的效果。 方法 雄性Wistar大鼠(200-240)40只，隨機分為三組：正常對照組(n=8只)，糖尿病組(n=16只)，纈沙坦組(n=16只)。糖尿病組和纈沙坦組給予高糖高熱量飲食，5周后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/Kg，溶解于10 mM冷檸檬酸鹽緩沖液中，PH4.2)。年齡匹配的正常對照組以標準大鼠飼料喂養(yǎng)，5

10、周后腹腔注射同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 72小時后取尾靜脈血測血糖，連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/1、胰島素敏感指數較正常對照組降低者進入下一步實驗。此后纈沙坦組大鼠每天以纈沙坦30mg/Kg灌胃，糖尿病組和正常對照組大鼠以生理鹽水灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)16周。實驗過程中，進行以下檢測：(1)每隔1周稱量體重1次，每隔2周檢測空腹血糖1次。(2)分別于STZ注射前、STZ注射后1周、實驗末抽血測定空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、

11、膽固醇，并計算胰島素敏感指數(ISI)。(3)分別于實驗開始前、模型組動物血糖升高后12周、實驗末對主動脈進行常規(guī)超聲心動圖檢查，評價其收縮期內徑、舒張期內徑和內膜中層厚度(IMT)。(4)主動脈組織超微結構和病理學檢查。(5)應用Masson染色進行血管組織間質膠原定量。(6)實時定量RT-PCR法檢測GATTS通路TSP-1、TGF-β<,1>、TGFβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad7等因子的mRNA表達。(7)免疫組織化學

12、檢測GATTS通路TSP-1、A-TGFβ<,1>、L-TGFβ<,1>、TGFβR II、P-Smad2/3、Smad7的蛋白表達。 結果 STZ糖尿病大鼠成模后，比對照組表現出代謝異常的特點，包括多飲、多尿、視力下降、消瘦和體重增長緩慢等糖尿病癥狀。 1體重與生化指標高糖高熱量飲食喂養(yǎng)4周后，與正常對照組相比，糖尿病組和纈沙坦組大鼠體重、空腹胰島素、甘油三酯和膽固醇水平較高(P<0.05)，胰島素敏感指數顯

13、著減低(P<0.01)，空腹血糖無明顯差異(P>0.05)。 STZ注射后1周，與正常對照組相比，糖尿病組和纈沙坦組大鼠體重、空腹胰島素水平無差異(P>0.05)，空腹血糖、甘油三酯和膽固醇水平明顯升高(P<0.01)，胰島素敏感指數依然顯著減低(P<0.01)。 實驗末，與正常對照組相比，糖尿病組和纈沙坦組大鼠體重、胰島素敏感指數顯著下降(P<0.01)；空腹血糖、甘油三酯和膽固醇水平明顯升高(P<0.01)，空腹

14、胰島素水平無明顯差異(P>0.05)。 實驗末尿量分析顯示，與對照組比較，糖尿病組與纈沙坦組大鼠24小時尿量均顯著增加(P<0.ore)；與糖尿病組比較，纈沙坦組尿量明顯減少(P<0.01)。 2主動脈超聲心動圖 (1)組間比較 血糖升高12周后，三組動物主動脈收縮期內徑、舒張期內徑、內膜中層厚度無明顯差異(P>0.05)。 實驗末，與對照組相比，糖尿病組收縮期內徑、舒張期內徑(P<0.0

15、1)NNN中層厚度(P<0.05)增大；纈沙坦組收縮期內徑、舒張期內徑亦增大(P<0.05)，但內膜中層厚度無變化(P>0.05)。糖尿病組與纈沙坦組相比無差異(P>0.05)。 (2)組內比較 血糖升高12周后，三組動物收縮期內徑和舒張期內徑均比實驗前變大(P<0.01)，但內膜中層厚度無變化(P>0.05)。 實驗末與實驗前比較，對照組舒張期內徑變大(P<0.05)，收縮期內徑無差異 (P>0.05)：

16、糖尿病組和纈沙坦組收縮期內徑和舒張期內徑均明顯變大(P<0.001)。三組動物內膜中層厚度均無變化(P>0.05)。 3透射電鏡觀察主動脈： 對照組主動脈中膜平滑肌細胞排列整齊，細胞周膜連續(xù)、完整；線粒體豐富、大小均一，呈圓形或橢圓形；核膜光滑、完整；彈力層連續(xù)、完整：細胞間質可見少量膠原纖維。 糖尿病組主動脈中膜平滑肌細胞排列紊亂，細胞周膜模糊、斷裂；線粒體明顯增多，呈堆積狀，腫脹、空泡化；核形狀不規(guī)則

17、，多見深切跡，核膜模糊不清；彈力層斷裂、不完整；間質可見大量膠原纖維分布，并深入彈力層，破壞彈力纖維；內膜不完整，內皮受到破壞。 纈沙坦組中膜平滑肌細胞排列較整齊，核形狀較糖尿病組規(guī)則，線粒體大小較一致，間質膠原纖維堆積明顯好轉。彈力層較完整。 4 組織病理觀察 HE染色切片上，正常大鼠主動脈內皮細胞扁平、完整，緊貼于平滑的內彈力板上。中膜平滑肌細胞排列整齊，細胞核大小均一，胞漿染色均勻；糖尿病組大鼠病灶

18、表面內皮細胞腫脹，局部內彈力板厚薄不勻或分層，血管平滑肌細胞排列稀疏、紊亂，細胞核大小不甚規(guī)則；纈沙坦組平滑肌細胞排列、細胞核形狀均較糖尿病組明顯好轉，而且很少見到內彈力板破壞現象。 Weigert間苯二酚．堿性品紅彈力纖維染色示，對照組彈力纖維完整，呈波浪狀收縮，糖尿病組彈力纖維斷裂、不完整，失去正常波浪收縮，纈沙坦組顯著改善。 5 Masson染色檢測膠原含量 對照組主動脈膠原纖維分布均勻，相鄰細胞間

19、膠原纖維網完好；糖尿病組膠原纖維明顯增多，圍繞平滑肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂；纈沙坦組膠原纖維較糖尿病組明顯減少，排列較規(guī)整。 定量分析顯示：糖尿病組主動脈膠原纖維(P<0.01)、血管膠原纖維/彈性纖維(C/E)比值(P<0.05)較對照組增大，纈沙坦組膠原纖維、C/E比值較糖尿病組減少(P<0.05)。糖尿病組血管膠原纖維、C/E比值與血糖水平顯著正相關(P<0.001)。 6 實時定量RT－PCR檢測GA

20、TTS通路各關鍵分子mRNA表達 與對照組相比，糖尿病組TSP-1、TGF-β<,1>、TβRII、Smad2、Smad3 mRNA表達水平以及Smad2/Smad7、Smad3/Smad7比值均明顯升高(P<0.050～0.01)，Smad7mRNA表達無差異(P>0.05)。 與對照組相比，纈沙坦組TSP-1、TGF-β<,1>、TβRII、Smad2、Smad3、Smad7 mRNA表達水平以及Smad2/S

21、mad7、Smad3/Smad7比值無差異(P>0.05)。 與糖尿病組相比，纈沙坦組TSP-1、TGF-β<,1>、TβRII、Smad2、Smad3 mRNA表達水平以及Smad2/Smad7、Smad3/Smad7比值明顯減低(P<0.05)。 相關性分析顯示，糖尿病組空腹血糖與TSP-1(P<0.01)、TGF-β<,1>(P<0.01)、TβRII(P<0.001)、Smad2(P<0.05)、Smad3(P

22、<0.01) mRNA表達呈明顯的正相關。膠原含量與TSP-1(P<0.001)、TGF-β<,1>(P<0.05)、T13RII(P<0.001)、Smad2(P<0.05)、Smad3(P<0.001) mRNA表達呈明顯的正相關。 7免疫組織化學染色分析 TSP-1、A-TGFβ<,1>、TGFl3R II：染色陽性信號為棕色顆粒、定位于血管平滑肌細胞胞漿內。正常對照組細胞胞漿內可見分布均勻、稀疏的淺棕色

23、顆粒，糖尿病組可見濃密的深棕色顆粒纈沙坦組較糖尿病組明顯稀疏，可見淺淡的棕色顆粒。 L-TGFβ<,1>：正常對照組細胞胞漿內可見分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，糖尿病組和纈沙坦組可見較多的深棕色顆粒。 P-Smad2/3：正常對照組細胞胞漿內幾乎未見P-Smad2/3表達，糖尿病組可見明顯的棕色顆粒，纈沙坦組細小棕色顆粒明顯減少。 Smad7：正常對照組細胞胞漿內可見分布均勻、稀疏的淺棕色顆粒，糖尿

24、病組棕色顆粒分布較正常對照組密集，纈沙坦組可見較糖尿病組著色更深、分布更密集的棕色顆粒。 8．各組大鼠GATTS通路各關鍵分子蛋白質表達水平檢測 與對照組相比，糖尿病組TSP-1、A-TGFβ<,1>、TflR、P-Smad2/3蛋白表達以及P-Smad2/3/Smad7蛋白水平比值均明顯升高(P<0.05～0.001)，L-TGFlβ<,1>、Smad7蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。 與對

25、照組相比，纈沙坦組TβR、P-Smad2/3蛋白表達以及P-Smad2/3/Smad7蛋白比值顯著升高(P<0.05～0.01)，TSP-1、L-TGFl3l、A-TGFIBl、Smad7蛋白表達無明顯差異(P>0.05)。 與糖尿病組相比，纈沙坦組TSP-1、L-TGFI～I、A-TGFl31、T13R、P-Smad2/3蛋白表達以及P-Smad2/3/Smad7蛋白水平比值明顯減低(P<0.05～0.01)，Smad7蛋白

26、表達無明顯差異(P>0.05)。 相關性分析顯示，糖尿病組空腹血糖與TSP-1(P<0.01)、A-TGFl3l(P<0.01)、TβR(P<0.01)、P-Smad2/3(P<0.01)蛋白表達水平呈明顯的正相關。膠原含量與TSP-1(P<0.01)、A-TGFβ<,1>(P<0.01)、TJ3R(P<0.01)、P-Smad2/3(P<0.01)蛋白表達水平呈明顯的正相關。結論1應用高熱量飲食喂飼和小劑量STZ注射，成

27、功地建立了符合2型糖尿病代謝特點的糖尿病大鼠模型，為糖尿病血管病變發(fā)病機制的研究提供了可靠平臺； 2糖尿病時，長期的高血糖環(huán)境引起主動脈壁膠原纖維相對增多、彈性纖維減少，C/E值增加，導致膠原沉積、血管纖維化，是糖尿病血管的主要組織病理變化； 3運用實時定量RT-PCR和免疫組化技術，在2型糖尿病動物模型中證實了葡萄糖/Ang Ii/TSP-1/TGF-β<,1>/Smads途徑(GATTS通路)的存在，表明TGF-β/