丹參-葛根對藥改善糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變之作用與機(jī)制研究.pdf

1、第一部分丹參-葛根對藥改善糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變的作用與機(jī)制研究
　　目的：探討中藥丹參-葛根對藥水提物（DG）對鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型主動(dòng)脈病變的作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法：丹參、葛根按1∶1重量比采用水提法制備DG。SD大鼠腹腔注射STZ（50 mg/kg/day），連續(xù)兩天，制備糖尿病大鼠模型。以STZ注射72 h后空腹血糖值≥11.1 mmol/L者視為糖尿病模

2、型大鼠。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為四組：對照組、模型組、DG低劑量組（50 mg/kg），DG高劑量組（200 mg/kg）。對照組及模型組灌胃給予等體積生理鹽水，每天一次，連續(xù)5?6周。每周測一次血糖和體重。制備離體主動(dòng)脈環(huán)，測定動(dòng)脈環(huán)對乙酰膽堿（Ach）的舒張反應(yīng)；測定血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxyde dismutase，SOD）、胰島素（insulin，INS）、過氧化氫（hydro

3、gen peroxide，H2O2）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、細(xì)胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1）、血管細(xì)胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）水平；HE染色法觀察主動(dòng)脈的病理學(xué)變化；免疫印跡方法檢測主動(dòng)脈中ICAM-1、VCAM-1、NADPH氧化酶2（ NADPH oxida

4、se2, NOX2）、NADPH氧化酶4（NADPH oxidase2, NOX4）、蛋白激酶C-β（protein kinase C-β, PKC-β）蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：結(jié)果顯示，大鼠連續(xù)2次給予STZ后，血糖明顯升高，均值達(dá)到13.99 mmol/L，體重明顯下降。DG給藥5-6周后，兩個(gè)劑量DG對空腹血糖均無影響，但能顯著降低糖尿病大鼠血漿INS、NO、H2O2、MDA、ICAM-1和VCAM-1的水平，增加糖尿病大鼠

5、血漿SOD水平。模型組胸主動(dòng)脈環(huán)對Ach的舒張作用明顯強(qiáng)于對照組(P＜0.01)，DG給藥明顯減弱糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒張作用(P＜0.01)。HE染色顯示， DG能改善糖尿病大鼠主動(dòng)脈壁增厚、水腫、細(xì)胞核增多、排列紊亂等病理變化；免疫印跡結(jié)果顯示DG給藥顯著抑制糖尿病大鼠主動(dòng)脈ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4、PKC-β蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：DG對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠主動(dòng)脈病變具有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制可能與

6、抑制PKC-β、NOX2、NOX4表達(dá)、降低氧化應(yīng)激，從而抑制ICAM-1、VCAM-1等細(xì)胞粘附分子的表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分丹參-葛根對藥抑制高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)的作用及機(jī)制研究
　　目的：本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）為工具，探討丹參-葛根對藥水提物（DG）抑制高糖誘導(dǎo)HUVECs粘附分子表達(dá)的作用及其可

7、能機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，給予不同濃度DG處理24h，顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化；MTT法測定DG對內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用。細(xì)胞分為5組，分別為對照組（Con）（5.5 mmol/L葡萄糖）、模型組（Mod)（30 mmol/L葡萄糖）、DG低劑量組（DG-L）（DG10μg/mL+30 mmol/L葡萄糖）、DG中劑量組（DG-M）（DG25μg/mL+30 mmol/L葡萄糖）、DG高劑量組（DG-H）（DG50μg

8、/mL+30 mmol/L葡萄糖）。共同作用12 h后，熒光探針DCFH2-DA檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成。DAPI熒光標(biāo)記的THP-1單核細(xì)胞，與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后，用熒光顯微鏡觀察DG對高糖誘導(dǎo)的單核-內(nèi)皮粘附作用的影響。Western blot法檢測ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白的表達(dá)。結(jié)果：DG處理內(nèi)皮細(xì)胞后，形態(tài)無明顯改變；MTT結(jié)

9、果顯示，DG處理內(nèi)皮后輕度促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖；高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成，這可被乙酰半胱氨酸（N-acetyl cysteine,NAC）所抑制，DG顯著抑制高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的ROS生成；DG顯著抑制高糖誘導(dǎo)的單核-內(nèi)皮粘附作用。Western blot結(jié)果顯示，高糖顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白的表達(dá)，DG可顯著逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的ICAM-1、VCAM-1、NOX2、NOX4和PKC-β蛋白