miR-20A-5p在缺氧-復氧誘導的肝細胞損傷中的作用及機制研究.pdf

1、研究目的:
　　缺血-再灌注損傷是臨床實踐中比較多見的病理過程，是指在組織或器官缺血一段時間后重新恢復血流灌注，組織器官功能不僅沒有恢復，反而缺血所致的損傷進一步加重的現(xiàn)象。在行肝臟手術時有時仍需要采取阻斷入肝血流來減少出血風險和降低手術難度，但殘余肝臟在恢復供血后會發(fā)生缺血-再灌注損傷，嚴重的甚至導致肝衰竭。特別是在長時間缺血情況下，如肝移植術后，缺血-再灌注損傷的發(fā)生更為常見。因此，研究肝臟缺血-再灌注損傷的發(fā)生機制，具有重要

2、的臨床價值。缺血-再灌注損傷涉及多種機制，包括線粒體功能紊亂、乳酸堆積和酸中毒、鈣離子超載、活性氧、自由基的生成和中性粒細胞活化等。
　　大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學作用。miRNA特異性的識別其作用靶基因mRNA的3'-非編碼區(qū)(3'-UTR)，降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯，降低效應蛋白水平。本研究旨在探討miRNA在肝臟缺血-再灌注中的作用，為肝臟缺血-再灌注損傷的預防和治療提供可能的理論依據(jù)。在前期

3、實驗中，以L02人肝細胞系建立了肝細胞缺氧/復氧模型，以在體外模擬肝臟缺血-再灌注過程。建模后，采用生物芯片技術對缺氧/復氧前后肝細胞中全部miRNA和mRNA表達變化進行檢測。結果顯示miR-20a-5p和HSP70mRNA在缺氧/復氧前后均存在顯著變化。
　　因此，本實驗擬探究miR-20a-5p和HSP70是否存在相互作用，以及它們對缺氧/復氧誘導的肝細胞損傷的影響，為臨床中肝臟缺血-再灌注損傷的預防和治療提供理論依據(jù)。

4、r>　　研究方法:
　　1、建模:體外培養(yǎng)L02肝細胞，分別建立缺氧和復氧時間梯度，用流式細胞術檢測細胞凋亡，篩選L02肝細胞缺氧/復氧模型的建立條件;
　　2、利用CCK8實驗檢測細胞凋亡，對缺氧/復氧模型進行驗證;
　　3、檢測在缺氧/復氧前后細胞培養(yǎng)液中ALT、AST的含量變化;
　　4、分別取對照組、缺氧組和復氧組，用基因芯片技術對全部miRNA和mRNA表達變化進行檢測;
　　5、利用Real-t

5、ime PCR技術檢測miR-20a-5p和HSP70mRNA在對照組、缺氧組和復氧組的變化;
　　6、利用Western blot檢測HSP70在對照組、缺氧組和復氧組的變化;
　　7、采用Lipofectamine2000將miR-20a-5p mimic轉染入L02細胞，以上調miR-20a-5p的表達，將miR-20a-5p inhibitor轉入細胞，以下調miR-20a-5p的表達;
　　8、在分別轉染mi

6、R-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后，利用流式細胞術和CCK-8實驗檢測肝細胞在缺氧/復氧前后細胞損傷的變化;
　　9、利用Targetscan生物信息學分析對miR-20a-5p的作用靶基因進行預測;
　　10、在分別轉染miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后，采用Western blot檢測肝細胞中HSP70在缺氧/復氧前后的變化;
　　11

7、、雙熒光素酶報告基因技術對miR-20a-5p與HSP70mRNA3'-UTR的結合進行檢測;
　　12、合成HSP70siRNA，用Lipofectamine2000瞬轉入L02細胞以敲低HSP70的表達，用Western blot檢測轉染效率;
　　13、將miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA同時轉入L02細胞，用CCK8試驗和流式細胞技術檢測缺氧/復氧后細胞的損傷情況，檢驗miR-20a-5p

8、 inhibitor在缺氧/復氧過程中對肝細胞的保護作用是否會被HSP70siRNA逆轉，以驗證miR-20a-5p是通過對基因HSP70的調控作用來誘導復氧后肝細胞的損傷;
　　14、將miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor分別轉入L02肝細胞，接著進行缺氧/復氧處理，用ATP檢測試劑盒檢測缺氧/復氧后各組ATP含量的變化;
　　15、將miR-20a-5pmimic和miR-20a-5

9、p inhibitor分別轉入L02肝細胞，接著進行缺氧/復氧處理，然后用Western blot檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax和胞質中細胞色素C(Cyt-c)的表達變化。
　　研究結果:
　　1、建模:流式細胞術檢測結果顯示缺氧12h，復氧12h后L02細胞損傷最為明顯，以此條件建立L02細胞缺氧/復氧模型;
　　2、基因芯片結果顯示，共檢測到miRNA2588個，檢測到mRNA19783個，其中miR-20a-

10、5p和HSP70mRNA在缺氧組和復氧組均存在明顯變化;
　　3、Real-time PCR結果顯示，miR-20a-5p在缺氧組表達下調，在復氧組表達上調;HSP70mRNA在缺氧組表達上調，在復氧組表達下調;
　　4、Western blot結果顯示，HSP70在缺氧組表達上調，在復氧組表達下調;
　　5、CCK8實驗和流式細胞術結果顯示，與對照組（轉染miR control）相比，轉染miR-20a-5pmimi

11、c組，在缺氧/復氧處理后細胞損傷加重;而在轉染miR-20a-5p inhibitor組，缺氧/復氧處理后細胞損傷明顯減輕;
　　6、TargetScan生物信息學分析發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p與HSP70mRNA3'-UTR存在可能的結合位點;
　　7、Western blot結果顯示，miR-20a-5p inhibitor可以抑制缺氧/復氧后HSP-70的下調;
　　8、雙熒光素酶基因報告檢測結果顯示，在HSP70

12、mRNA3'-UTR存在miR-20a-5p的結合位點。miR-20a-Sp通過作用于HSP70mRNA3'-UTR來抑制蛋白HSP-70的表達;
　　9、與單獨轉染miR-20a-5p inhibitor相比，同時將miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA轉入L02細胞，缺氧/復氧處理后細胞損傷加重。說明在缺氧/復氧過程中，miR-20a-5p inhibitor對肝細胞的保護作用能夠被HSP70siRNA

13、逆轉;
　　10、轉染miR-20a-5p inhibitor后再進行缺氧/復氧處理組較只進行缺氧/復氧處理組肝細胞ATP表達量增加。說明缺氧/復氧后miR-20a-5p的上調導致了線粒體功能的紊亂;
　　11、轉染miR-20a-5p inhibitor后再進行缺氧/復氧處理組較只進行缺氧/復氧處理組Bax和胞質中Cyt-c表達均下調，而Bcl-2在缺氧/復氧后各組間變化不明顯。這表明缺氧/復氧后miR-20a-5p上調抑