miR-20A-5p在缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　缺血-再灌注損傷是臨床實(shí)踐中比較多見的病理過程，是指在組織或器官缺血一段時(shí)間后重新恢復(fù)血流灌注，組織器官功能不僅沒有恢復(fù)，反而缺血所致的損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。在行肝臟手術(shù)時(shí)有時(shí)仍需要采取阻斷入肝血流來減少出血風(fēng)險(xiǎn)和降低手術(shù)難度，但殘余肝臟在恢復(fù)供血后會(huì)發(fā)生缺血-再灌注損傷，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致肝衰竭。特別是在長時(shí)間缺血情況下，如肝移植術(shù)后，缺血-再灌注損傷的發(fā)生更為常見。因此，研究肝臟缺血-再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，具有重要

2、的臨床價(jià)值。缺血-再灌注損傷涉及多種機(jī)制，包括線粒體功能紊亂、乳酸堆積和酸中毒、鈣離子超載、活性氧、自由基的生成和中性粒細(xì)胞活化等。
　　大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。miRNA特異性的識(shí)別其作用靶基因mRNA的3'-非編碼區(qū)(3'-UTR)，降解mRNA或者抑制mRNA的翻譯，降低效應(yīng)蛋白水平。本研究旨在探討miRNA在肝臟缺血-再灌注中的作用，為肝臟缺血-再灌注損傷的預(yù)防和治療提供可能的理論依據(jù)。在前期

3、實(shí)驗(yàn)中，以L02人肝細(xì)胞系建立了肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，以在體外模擬肝臟缺血-再灌注過程。建模后，采用生物芯片技術(shù)對(duì)缺氧/復(fù)氧前后肝細(xì)胞中全部miRNA和mRNA表達(dá)變化進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示miR-20a-5p和HSP70mRNA在缺氧/復(fù)氧前后均存在顯著變化。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)擬探究miR-20a-5p和HSP70是否存在相互作用，以及它們對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的影響，為臨床中肝臟缺血-再灌注損傷的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

4、r>　　研究方法:
　　1、建模:體外培養(yǎng)L02肝細(xì)胞，分別建立缺氧和復(fù)氧時(shí)間梯度，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，篩選L02肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立條件;
　　2、利用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞凋亡，對(duì)缺氧/復(fù)氧模型進(jìn)行驗(yàn)證;
　　3、檢測在缺氧/復(fù)氧前后細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST的含量變化;
　　4、分別取對(duì)照組、缺氧組和復(fù)氧組，用基因芯片技術(shù)對(duì)全部miRNA和mRNA表達(dá)變化進(jìn)行檢測;
　　5、利用Real-t

5、ime PCR技術(shù)檢測miR-20a-5p和HSP70mRNA在對(duì)照組、缺氧組和復(fù)氧組的變化;
　　6、利用Western blot檢測HSP70在對(duì)照組、缺氧組和復(fù)氧組的變化;
　　7、采用Lipofectamine2000將miR-20a-5p mimic轉(zhuǎn)染入L02細(xì)胞，以上調(diào)miR-20a-5p的表達(dá)，將miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)入細(xì)胞，以下調(diào)miR-20a-5p的表達(dá);
　　8、在分別轉(zhuǎn)染mi

6、R-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后，利用流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測肝細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧前后細(xì)胞損傷的變化;
　　9、利用Targetscan生物信息學(xué)分析對(duì)miR-20a-5p的作用靶基因進(jìn)行預(yù)測;
　　10、在分別轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor后，采用Western blot檢測肝細(xì)胞中HSP70在缺氧/復(fù)氧前后的變化;
　　11

7、、雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)對(duì)miR-20a-5p與HSP70mRNA3'-UTR的結(jié)合進(jìn)行檢測;
　　12、合成HSP70siRNA，用Lipofectamine2000瞬轉(zhuǎn)入L02細(xì)胞以敲低HSP70的表達(dá)，用Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率;
　　13、將miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA同時(shí)轉(zhuǎn)入L02細(xì)胞，用CCK8試驗(yàn)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞的損傷情況，檢驗(yàn)miR-20a-5p

8、 inhibitor在缺氧/復(fù)氧過程中對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用是否會(huì)被HSP70siRNA逆轉(zhuǎn)，以驗(yàn)證miR-20a-5p是通過對(duì)基因HSP70的調(diào)控作用來誘導(dǎo)復(fù)氧后肝細(xì)胞的損傷;
　　14、將miR-20a-5p mimic和miR-20a-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)入L02肝細(xì)胞，接著進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，用ATP檢測試劑盒檢測缺氧/復(fù)氧后各組ATP含量的變化;
　　15、將miR-20a-5pmimic和miR-20a-5

9、p inhibitor分別轉(zhuǎn)入L02肝細(xì)胞，接著進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，然后用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和胞質(zhì)中細(xì)胞色素C(Cyt-c)的表達(dá)變化。
　　研究結(jié)果:
　　1、建模:流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示缺氧12h，復(fù)氧12h后L02細(xì)胞損傷最為明顯，以此條件建立L02細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型;
　　2、基因芯片結(jié)果顯示，共檢測到miRNA2588個(gè)，檢測到mRNA19783個(gè)，其中miR-20a-

10、5p和HSP70mRNA在缺氧組和復(fù)氧組均存在明顯變化;
　　3、Real-time PCR結(jié)果顯示，miR-20a-5p在缺氧組表達(dá)下調(diào)，在復(fù)氧組表達(dá)上調(diào);HSP70mRNA在缺氧組表達(dá)上調(diào)，在復(fù)氧組表達(dá)下調(diào);
　　4、Western blot結(jié)果顯示，HSP70在缺氧組表達(dá)上調(diào)，在復(fù)氧組表達(dá)下調(diào);
　　5、CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組（轉(zhuǎn)染miR control）相比，轉(zhuǎn)染miR-20a-5pmimi

11、c組，在缺氧/復(fù)氧處理后細(xì)胞損傷加重;而在轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor組，缺氧/復(fù)氧處理后細(xì)胞損傷明顯減輕;
　　6、TargetScan生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p與HSP70mRNA3'-UTR存在可能的結(jié)合位點(diǎn);
　　7、Western blot結(jié)果顯示，miR-20a-5p inhibitor可以抑制缺氧/復(fù)氧后HSP-70的下調(diào);
　　8、雙熒光素酶基因報(bào)告檢測結(jié)果顯示，在HSP70

12、mRNA3'-UTR存在miR-20a-5p的結(jié)合位點(diǎn)。miR-20a-Sp通過作用于HSP70mRNA3'-UTR來抑制蛋白HSP-70的表達(dá);
　　9、與單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor相比，同時(shí)將miR-20a-5p inhibitor和HSP70siRNA轉(zhuǎn)入L02細(xì)胞，缺氧/復(fù)氧處理后細(xì)胞損傷加重。說明在缺氧/復(fù)氧過程中，miR-20a-5p inhibitor對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用能夠被HSP70siRNA

13、逆轉(zhuǎn);
　　10、轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor后再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理組較只進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理組肝細(xì)胞ATP表達(dá)量增加。說明缺氧/復(fù)氧后miR-20a-5p的上調(diào)導(dǎo)致了線粒體功能的紊亂;
　　11、轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor后再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理組較只進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理組Bax和胞質(zhì)中Cyt-c表達(dá)均下調(diào)，而Bcl-2在缺氧/復(fù)氧后各組間變化不明顯。這表明缺氧/復(fù)氧后miR-20a-5p上調(diào)抑