冷誘導RNA結(jié)合蛋白在缺氧復氧損傷中的心肌保護作用研究.pdf

1、目的:
　　探索H9c2心肌細胞在缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)條件下冷誘導RNA結(jié)合蛋白(CIRP)的表達及其在心肌細胞缺氧/復氧損傷中所起的具體作用。
　　方法:
　　(1)缺氧復氧的模型(95％N2和5%CO2)的建立,采用的是H9c2心肌細胞,在體外培養(yǎng)建成。
　　(2)檢測CIRP在缺氧/復氧過程中,mRNA及蛋白的表達概況,采用的是RT-PCR來檢測mRNA的表達,

2、Western blot印跡法來檢測蛋白的表達,并要著重注意兩者在缺氧/復氧過程中表達最高的時間點,作為后續(xù)試驗中缺氧復氧時間。
　　(3)缺氧復氧處理選擇在缺氧14h及復氧2h兩個時間點上進行,實驗時共分為10組同時進行,分別為:
　?、僬φ战M;
　?、贖/R組;
　?、跜IRPsiRNA處理細胞組;
　　④CIRPsiRNA處理細胞+H/R組;
　?、蓐幮愿蓴_處理細胞組;
　?、揸幮愿蓴_

3、處理細胞+H/R組;
　?、逤IRP過表達質(zhì)粒處理細胞組;
　?、郈IRP過表達質(zhì)粒處理細胞+H/R組;
　?、峥蛰d質(zhì)粒處理細胞組;
　?、饪蛰d質(zhì)粒處理細胞+H/R組.
　　(4)用western blot印跡法檢測CIRP和凋亡蛋白caspase-3的表達情況,流式細胞儀檢測各組凋亡狀況。
　　結(jié)果:
　　(1)心肌細胞缺氧處理時,RT-PCR顯示CIRPmRNA表達兩小時有所下降,之后有明顯

4、增加,在14小時到達最高。western blot印跡法顯示CIRP蛋白表達隨著缺氧有明顯增加趨勢,到14小時出現(xiàn)高峰。流式檢測表示隨著缺氧時間增加凋亡增加,6小時和8小時達高峰。
　　(2)在缺氧14小時,0~8小時的復氧時間里,CIRP在缺氧14小時復氧2h這個時間表達最高。
　　(3)通過外源性轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒使 CIRP過表達并缺氧復氧組細胞caspase-3表達和凋亡率低于單純?nèi)毖鯊脱踅M,并具有統(tǒng)計學意義P<0.05

5、;轉(zhuǎn)染CIRPsiRNA并缺氧復氧組細胞caspase-3蛋白表達量和凋亡率明顯高于單純?nèi)毖鯊脱踅M細胞,并有統(tǒng)計學意義P<0.05。單純過表達CIRP組細胞caspase-3蛋白表達低于正常組,有統(tǒng)計學意義P<0.05,凋亡率低于正常組,有統(tǒng)計學意義P<0.05;單純干擾細胞CIRP表達組caspase-3蛋白表達和細胞凋亡率高于正常組,有統(tǒng)計學意義P<0.05。
　　結(jié)論:
　　(1)H9c2細胞中CIRP正常情況下存在低

6、水平表達。
　　(2)H9c2心肌細胞在缺氧/復氧條件下,隨著缺氧時間增加冷誘導RNA結(jié)合蛋白表達逐漸增加,在缺氧14小時及復氧2小時這兩個時間點上,出現(xiàn)表達高峰。
　　(3)在缺氧14小時及復氧2小時這兩個時間點上,高表達的CIRP能夠抑制H9c2心肌細胞的凋亡;
　　(4)在缺氧14小時及復氧2小時這兩個時間點上,如果干擾CIRP表達,則可以促進H9c2心肌細胞的凋亡。
　　(5)過表達CIRP可使H9c2心