冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)在慢性組織缺氧致冷敏感的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：明確慢性阻塞性疾病患者和正常人群支氣管上皮，冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠和正常大鼠支氣管上皮以及正常人支氣管上皮細(xì)胞（NHBE）株中CIRP的定位和表達(dá)情況。構(gòu)建慢性組織缺氧的冷敏感在體大鼠和離體細(xì)胞模型，探討CIRP在慢性組織缺氧的慢阻肺患者冷敏感及其誘導(dǎo)的炎性因子浸潤(rùn)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　(1)目標(biāo)人群、冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠、正常大鼠支氣管上皮以及正常人支氣管上皮NHBE細(xì)胞株中CIRP的定位和表達(dá)

2、情況構(gòu)建慢性組織缺氧及冷敏感大鼠和低氧、低溫細(xì)胞模型，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)目標(biāo)人群、冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠和正常大鼠支氣管上皮中CIRP的分布特征，激光共聚焦顯微鏡觀察冷刺激前后CIRP蛋白在NHBE細(xì)胞內(nèi)定位及分布情況。再通過Real time-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)目標(biāo)人群、冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠和正常大鼠支氣管粘膜上皮以及NHBE細(xì)胞株中CIRP的基因和蛋白表達(dá)水平。
　　(2) C

3、IRP在低溫、低氧環(huán)境下的促炎分泌效應(yīng)
　　構(gòu)建CIRP-shRNA質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Real time-PCR和Western blotting法檢測(cè)CIRP特異性shRNA的沉默效率。給予最適冷刺激溫度和時(shí)長(zhǎng)刺激NHBE細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)冷刺激前后CIRP的胞內(nèi)定位及表達(dá)情況，Real time-PCR、Western blotting及ELISA法分別觀察各組細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中的CIRP和炎性因子表達(dá)含量，明確CIRP

4、在低溫低氧情況下的促炎效應(yīng)。
　　(3)應(yīng)激顆粒參與CIRP介導(dǎo)的促炎效應(yīng)
　　構(gòu)建eIF2α-siRNA和CIRP-shRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，Real time-PCR和Western blotting法檢測(cè)eIF2α特異性siRNA的沉默效率。給予最適冷刺激溫度和時(shí)長(zhǎng)刺激NHBE細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光觀察應(yīng)激顆粒(eIF2α標(biāo)記)的胞內(nèi)情況，Real time-PCR、Western blotting及ELISA法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染

5、前后各種細(xì)胞中CIRP、炎性因子基因和蛋白的表達(dá)水平，明確應(yīng)激顆粒參與CIRP介導(dǎo)的促炎效應(yīng)。
　　(4) CIRP對(duì)炎癥因子的mRNA3′UTR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制
　　構(gòu)建雙重?zé)晒馑孛富蛘婧吮磉_(dá)質(zhì)粒(pGL3-TNF-α3′UTR、pGL4.75-IL-83′UTR和pGL3-IL-63′UTR)及pSVRenilla luciferase，用Lipo2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒于穩(wěn)轉(zhuǎn)CIRP-shRNA的NHBE細(xì)胞株，再給予最適冷

6、刺激，采用雙重?zé)晒馑孛富驒z測(cè)技術(shù)檢測(cè)刺激前后熒光素酶的活性；制備體外生物素(biotin)標(biāo)記的炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的mRNA3′UTR探針，采用RNA pull-down技術(shù)檢測(cè)CIRP與炎癥因子mRNA3′UTR的特異性結(jié)合；構(gòu)建CIRP-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，給予最適冷刺激后加入Actinomycin D終止轉(zhuǎn)錄，通過Real-time PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)炎性因子mRNA的表達(dá)量，用Opticon2.02

7、軟件分析不同時(shí)段mRNA的表達(dá)量并計(jì)算出其半衰期(t1/2)，從而分析mRNA的穩(wěn)定性，明確CIRP介導(dǎo)慢性缺氧狀態(tài)下冷應(yīng)激誘導(dǎo)的炎性因子mRNA的穩(wěn)定性調(diào)控作用。
　　結(jié)果：
　　(1)目標(biāo)人群、冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠、正常大鼠支氣管上皮以及正常人支氣管上皮NHBE細(xì)胞株中CIRP的定位和表達(dá)情況慢性阻塞性肺疾病患者、正常人群支氣管上皮細(xì)胞、冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠支氣管及健康大鼠支氣管上皮細(xì)胞均有CIRP表達(dá)，

8、且慢性阻塞性肺疾病患者中CIRP表達(dá)明顯高于正常健康人群，冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠中CIRP表達(dá)明顯高于健康大鼠，主要定位于細(xì)胞胞漿中。當(dāng)給予冷刺激后，細(xì)胞中CIRP呈高表達(dá)狀態(tài)，主要富集于細(xì)胞胞漿中。
　　(2) CIRP在低溫、低氧環(huán)境下的促炎分泌效應(yīng)
　　成功構(gòu)建CIRP-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，CIRP-shRNA具備較理想的沉默效率。在CIRP-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，當(dāng)給予冷刺激后，CIRP-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)

9、幾乎無CIRP表達(dá)?？梢奀IRP-shRNA可顯著阻斷冷刺激誘導(dǎo)的CIRP表達(dá)和炎癥反應(yīng)。
　　(3)應(yīng)激顆粒參與CIRP介導(dǎo)的促炎效應(yīng)
　　eIF2α-siRNA可明顯抑制慢性缺氧狀態(tài)下冷應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-8)mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。單獨(dú)轉(zhuǎn)染eIF2α-siRNA或CIRP-shRNA或共轉(zhuǎn)染組，細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激顆粒(藍(lán)色)的數(shù)量明顯減少。在基因和蛋白表達(dá)水平

10、上進(jìn)一步觀察，上述各種細(xì)胞胞漿內(nèi)其表達(dá)量均明顯降低，但eIF2α-siRNA單獨(dú)轉(zhuǎn)染組中，CIRP mRNA和蛋白表達(dá)量無明顯變化。
　　(4) CIRP對(duì)炎癥因子mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制
　　分別構(gòu)建雙重?zé)晒馑孛富蛘婧吮磉_(dá)質(zhì)粒(pGL3-TNF-α3′UTR、pGL4.75-IL-83′UTR和pGL3-IL-63′UTR),轉(zhuǎn)染熒光素酶基因真核表達(dá)質(zhì)粒及pSVRenilla luciferase于NHBE細(xì)胞株或穩(wěn)轉(zhuǎn)C

11、IRP-shRNA的NHBE細(xì)胞株，每組給予相同冷刺激和作用時(shí)長(zhǎng)處理后，熒光素酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CIRP-shRNA后熒光素酶活性明顯降低；轉(zhuǎn)染炎癥因子的mRNA3′UTR基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株給予冷刺激后，用生物素標(biāo)記的炎癥因子的mRNA3′UTR探針進(jìn)行RNA pull-down,其結(jié)果顯示冷刺激組中特異性結(jié)合的CIRP蛋白較未給予冷刺激組明顯增高。通過檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(1.5 h,3 h和3 h)上三種炎性因子的mRNA的表達(dá)

12、水平，我們發(fā)現(xiàn)低氧低溫刺激后各時(shí)間點(diǎn)上的mRNA的表達(dá)水平均無明顯差異，其半衰期明顯延長(zhǎng)，而在轉(zhuǎn)染CIRP-shRNA組中，炎癥因子的mRNA在3 h和6 h的表達(dá)量具有明顯差異，6 h時(shí)mRNA的表達(dá)量明顯降低，其半衰期明顯縮短。
　　結(jié)論：
　　(1)慢性阻塞性肺疾病患者和冷應(yīng)激狀態(tài)下慢性組織缺氧大鼠支氣管上皮中CIRP呈高表達(dá)狀態(tài)，并富集于靠管腔細(xì)胞的胞漿中；
　　(2)低溫低氧可誘導(dǎo)NHBE細(xì)胞CIRP的高表達(dá)

13、，并促使其由聚集于胞漿內(nèi)；
　　(3) CIRP mRNA和蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和部分低溫賴性增加；
　　(4) CIRP介導(dǎo)了低溫低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；
　　(5)冷刺激可誘導(dǎo)CIRP聚集于細(xì)胞的胞漿中，可向胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)激顆粒移動(dòng)并聚集。并且，CIRP還可促進(jìn)應(yīng)激顆粒的形成，二者共同參與了低氧低溫誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)；
　　(6)在冷應(yīng)激狀態(tài)下，CIRP具有增加炎癥因子的mRNA穩(wěn)定性，從而提高mRNA的翻譯效率和速率