組織型激肽釋放酶在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、第一章質(zhì)譜技術(shù)鑒定組織型激肽釋放酶腦相關(guān)蛋白
　　[目的]
　　為進(jìn)一步闡明組織型激肽釋放酶(Tissue kallikrein,TK)的腦保護(hù)機(jī)制,采用質(zhì)譜技術(shù)鑒定出TK的腦相關(guān)蛋白。
　　[方法]
　　1.分別采用兩種方法獲得差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析:其一,為尋找Neuro-2a細(xì)胞膜上與TK相關(guān)的蛋白,分別將包含全長、無信號肽的TK基因質(zhì)粒(GFP-TK-full和GFP-TK-no)轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細(xì)胞

2、,轉(zhuǎn)染24～36h以后,生物素標(biāo)記Neuro-2a細(xì)胞膜,細(xì)胞裂解液用兔源性抗GFP抗體進(jìn)行免疫共沉淀,然后用特異性識別生物素的鏈親和素-辣根過氧化物酶進(jìn)行檢測;其二,將純化的TK蛋白與大鼠腦組織抽提上清液混勻作用,用兔源性抗TK抗體或IgG進(jìn)行免疫共沉淀,裂解蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳銀染;
　　2.將上述電泳所得差異蛋白切膠酶解打質(zhì)譜,并將數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)處理;
　　3.RT-PCR檢測缺氧再復(fù)氧的Neuro-2a細(xì)胞中,

3、內(nèi)源性差異蛋白在TK(10,100,1000 nM)處理后的表達(dá)變化,篩選出可能與TK相關(guān)的蛋白。
　　[結(jié)果]
　　1.生物素標(biāo)記結(jié)果顯示:GFP-TK-full轉(zhuǎn)染組較GFP-TK-no和GFP兩轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)兩條差異蛋白條帶,分子量分別為64kDa和49kDa;
　　2.TK純化蛋白與大鼠腦組織作用后結(jié)果顯示:用抗TK抗體免疫共沉淀后有一條差異蛋白,分子量約為64kDa;
　　3.質(zhì)譜鑒定出19種差異蛋白;

4、r>　　4.TK濃度依賴性上調(diào)Homerlb/c和Flotillin-2的mRNA表達(dá)。
　　[結(jié)論]
　　質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示與TK相關(guān)的腦蛋白分子量大約在40～65kDa之間。TK的作用機(jī)制很可能與Homerlb/c和Flotillin-2兩者有關(guān),我們將把Homerlb/c作為研究TK作用機(jī)制的靶蛋白。
　　第二章組織型激肽釋放酶在缺氧誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞損傷中通過Homer發(fā)揮抗凋亡作用
　　[目的]<

5、br>　　闡明TK在缺氧誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞損傷中通過Homerlb/c發(fā)揮其抗凋亡作用。
　　[方法]
　　1.構(gòu)建小鼠pcDNA3.1-Homerlb/c質(zhì)粒,合成針對小鼠Homerlb/c特定序列的siRNA,并分別將其轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細(xì)胞,上調(diào)及下調(diào)Homerlb/c的表達(dá),RT-PCR和western-blot分別檢測轉(zhuǎn)染后Homerlb/c的mRNA和蛋白水平;
　　2.分別上調(diào)及下調(diào)Neuro

6、-2a細(xì)胞中Homerlb/c的表達(dá),CCK-8方法測定細(xì)胞的存活率,LDH釋放、caspaSe-3活性及Hochcst染色檢測細(xì)胞凋亡,觀察Homerlb/c在Neuro-2a細(xì)胞缺氧損傷中的作用;
　　3.RT-PCR和western-blot分別檢測缺氧復(fù)氧后不同時間點,TK(100 nM)孵育后Homerlb/c的mRNA和蛋白表達(dá);激光共聚焦觀察Homerlb/c在缺氧及TK作用下的表達(dá)及定位;
　　4.分別上調(diào)及

7、下調(diào)Neuro-2a細(xì)胞中Homerb/c的表達(dá),并予細(xì)胞缺氧和TK干預(yù),CCK-8方法測定細(xì)胞的存活率,LDH釋放、caspase-3活性及Hochcst染色檢測細(xì)胞凋亡,觀察TK的抗凋亡作用是否與Homerlb/c有關(guān);
　　5.在上述條件下,western-blot檢測ERKl/2、P38、JNK、Akt、GSK3β的磷酸化水平,激光共聚焦觀察磷酸化的ERKl/2的表達(dá),western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、B

8、ax的表達(dá),研究TK與Homerlb/c及其下游信號通路間的關(guān)系;
　　6.過表達(dá)Homerlb/c,PD98059和LY294002分別抑制ERKl/2和P13K信號通路,CCK-8方法測定細(xì)胞的存活率,LDH釋放量檢測細(xì)胞凋亡,觀察Homerlb/c在缺氧細(xì)胞中的作用與下游信號通路間的關(guān)系。
　　[結(jié)果]
　　1.peDNA3.1-Homerlb/c和Homerlb/c siRNA轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞后,Hom

9、erlb/e的表達(dá)(mRNA和蛋白表達(dá))分別明顯上調(diào)及下調(diào);
　　2.Homerlb/c在Nero-2a細(xì)胞缺氧損傷中有抗凋亡作用:上調(diào)Homerlb/c的表達(dá)提高了細(xì)胞生存率,降低了細(xì)胞LDH釋放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡細(xì)胞數(shù)目;而下調(diào)Homerlb/c后與上述效應(yīng)相反;
　　3.TK上調(diào)Neuro-2a細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷中Homerlb/c的mRNA和蛋白表達(dá),及促進(jìn)Homerlb/c的膜轉(zhuǎn)位;

10、r>　　4.TK在Neuro-2a細(xì)胞缺氧損傷中通過Homerlb/c起抗凋亡作用:上調(diào)Homerlb/c,同時給予細(xì)胞缺氧和TK干預(yù),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生存率明顯提高,細(xì)胞LDH釋放、caspase-3活性及Hochest染色凋亡細(xì)胞數(shù)目降低,提示Homerlb/c的過表達(dá)促進(jìn)了TK的抗凋亡作用;相反,發(fā)現(xiàn)下調(diào)Homerlb/c后抑制了TK的抗凋亡作用;
　　5.TK通過Homerlb/c激活下游信號通路:在缺氧條件下,TK明顯增高了ER

11、Kl/2、Akt、GSK3β的磷酸化水平;而下調(diào)Homerlb/c后發(fā)現(xiàn),TK的該促磷酸化作用明顯降低;激光共聚焦實驗顯示,上調(diào)及下調(diào)Homerlb/c后,分別提高及降低了TK的促磷酸化作用;
　　6.TK可能通過Homerlb/c促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),而抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá):在缺氧條件下,TK明顯提高了Bcl-2的表達(dá),降低了Bax的表達(dá);而下調(diào)Homerlb/c后,TK的促Bcl-2表達(dá)的作用明顯降低,Bax的

12、表達(dá)明顯增高;
　　7.Homerlb/c通過ERKl/2和P13K信號通路起抗凋亡作用:上調(diào)Homerlb/c的表達(dá),予細(xì)胞缺氧刺激,PD98059和LY294002均抑制了Homerlb/c過表達(dá)后的抗凋亡作用。
　　[結(jié)論]
　　在Neuro-2a細(xì)胞缺氧損傷中,TK通過上調(diào)Homerlb/c的表達(dá)激活ERKl/2和PI3K-Akt-GSK3β信號通路,而發(fā)揮其抗凋亡作用。此外,上調(diào)Homerlb/c的表達(dá)抑制了

13、缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　第三章缺氧及酸誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞中Homer的表達(dá)變化及其機(jī)制的研究
　　[目的]
　　探討缺氧及酸處理誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞中Homer的表達(dá)變化及其機(jī)制。
　　[方法]
　　1.缺氧或酸處理再灌注后不同時間點,RT-PCR和western-blot分別檢測Homerla、1b/c的mRNA和蛋白表達(dá);持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,RT-PCR檢測Homerla的mRN

14、A表達(dá),觀察缺氧或酸處理對Homer表達(dá)變化的影響;其中,在酸處理組均加入谷氨酸受體抑制劑CNQX和MK801、電壓門控鈣通道阻斷劑尼莫地平,阻斷經(jīng)典鈣通道顯示ASICs的活性,以下實驗相同;
　　2.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,CCK-8方法檢測細(xì)胞存活率,LDH釋放檢測細(xì)胞凋亡,觀察兩種刺激對細(xì)胞功能的影響;
　　3.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理不同時間點,western-blot檢測ERKl/2和Akt的磷酸化水平,觀察兩

15、種刺激對細(xì)胞信號通路的影響;
　　4.給予細(xì)胞缺氧和ERKl/2抑制劑PD98059處理,RT-PCR檢測Homerla、1b/c的表達(dá),觀察缺氧誘導(dǎo)的Homer的表達(dá)變化是否與ERKl/2信號通路有關(guān);給予細(xì)胞酸、PD98059和PI3K抑制劑LY294002處理,RT-PCR檢測Homerla、1 b/c的表達(dá),觀察酸誘導(dǎo)的Homer的表達(dá)變化是否與ERKl/2和PI3K-Akt信號通路有關(guān);給予細(xì)胞酸、ASICla特異及非特

16、異抑制劑PcTX和鹽酸阿米洛利(amiloride)、鈣離子螯合劑EGTA,RT-PCR撿測Homerla、1b/c的表達(dá),觀察酸誘導(dǎo)的Homer的表達(dá)變化是否與ASICla介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)。
　　[結(jié)果]
　　1.缺氧或酸處理再灌注后均可誘導(dǎo)Homerla的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);持續(xù)缺氧或持續(xù)酸處理均在刺激后3h Homerla的表達(dá)至最高峰,且酸較缺氧處理誘導(dǎo)的Homerla的表達(dá)更高且持久;
　　2.持續(xù)

17、缺氧或持續(xù)酸刺激,細(xì)胞生存率逐漸降低,LDH釋放逐漸增加,且酸較缺氧處理導(dǎo)致細(xì)胞損傷更嚴(yán)重;
　　3.持續(xù)缺氧或持續(xù)酸刺激,細(xì)胞ERKl/2和Akt的磷酸化水平動態(tài)改變,均在刺激后30 min表達(dá)最高;
　　4.PD98059抑制了缺氧誘導(dǎo)的Homerla mRNA的表達(dá)上調(diào);PD98059和LY294002分別抑制了酸誘導(dǎo)的Homerla mRNA的表達(dá)上調(diào);PcTX、amiloride和EGTA分別抑制了酸誘導(dǎo)的Home

18、rla mRNA的表達(dá)上調(diào)。
　　[結(jié)論]
　　缺氧及酸均可誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞中Homerla的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。缺氧上調(diào)Homerla的mRNA表達(dá)通過ERKl/2信號通路;酸上調(diào)Homerla的mRNA表達(dá)通過ERKl/2、PI3K-Akt信號通路及ASICla介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流途徑。而且,酸較缺氧處理誘導(dǎo)Homerla的表達(dá)更高且持久,細(xì)胞損傷更嚴(yán)重,且通過多條信號通路上調(diào)Homerla的表達(dá),表明酸處理可