NOR1基因的缺氧敏感性表達及誘導HeLa細胞凋亡的分子機制.pdf

1、[NOR1基因的克隆及前期研究基礎]
　　 通過抑制性消減雜交和cDNA微陣列技術，發(fā)現(xiàn)NOR1的EST W95442在正常鼻咽上皮與鼻咽癌組織中存在表達差異。借助于生物信息學，采用EST介導的cDNA克隆方法，得到了EST W95442相應的NOR1全長cDNA序列。將NOR1轉入鼻咽癌細胞HNE1后可以抑制HNE1細胞的生長、增殖。在25例鼻咽癌及4例正常鼻咽上皮組織中發(fā)現(xiàn)NOR1的1號外顯子區(qū)存在一個非同義的編碼區(qū)單核苷酸

2、多態(tài)性(coding Single nucleotidepolymorphism，cSNP)(Glu58Gly)。多組織膜Northern-blot分析表明，NOR1在人的骨骼肌表達最高，其次是心、腦、腎、肺。這些組織都是機體代謝功能、細胞呼吸較為旺盛部位。生物信息學預測NOR1含一個Nitro-oxidored domain，編碼一種潛在的氧化還原酶，主要定位在胞漿，少量位于線粒體，提示NOR1的功能可能與細胞有氧呼吸和/或細胞的代謝

3、密切相關。
　　 [NOR1在多種腫瘤中表達下調，且在缺氧誘導下表達升高]
　　 前期原位雜交的研究結果表明，NOR1的表達差異僅在腫瘤與非腫瘤組織之間，并且這種差異與腫瘤的臨床病理組織類型和腫瘤的轉移無關，提示NOR1的下調是腫瘤發(fā)生的早期事件。利用CLONTECH公司的cancer profiling array（包含19種腫瘤組織以及相應的癌旁組織）檢測發(fā)現(xiàn):NOR1在肝癌、胰腺癌、肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、子宮癌、

4、卵巢癌、外陰上皮癌、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、皮膚癌的腫瘤組織中表達明顯下調，說明NOR1的表達下調與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。
　　 本研究以及前期研究所檢測的腫瘤均為實體瘤，而缺氧是實體腫瘤發(fā)生早期的共同事件。作為具有潛在氧化還原酶功能的NOR1，其表達是否會因細胞氧化還原環(huán)境的改變（如:缺氧等刺激）而改變？令人驚奇的是，利用缺氧、氯化鈷(CoCl2)以及H2O2分別對HeLa細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)NOR1的表達均明顯上調，并且

5、處理后的HeLa細胞周期阻滯在S、G2期（其中缺氧誘導是S期，CoCl2誘導是S、G2期而H2O2則只是G2期）。缺氧誘導因子(hypoxia induced factor，HIF-1α)是通過缺氧應激啟動的轉錄因子，NOR1的上調可能受HIF-1的調節(jié)。經antisense-HIF-1轉染HeLa細胞并通過CoCl2誘導，NOR1的表達并未隨HIF-1表達下調而下降，提示NOR1的表達與HIF-1無明顯相關。
　　 檢測腫瘤組

6、織的NOR1表達為下調，而體外的缺氧誘導卻使NOR1表達升高，出現(xiàn)這種矛盾是因何原因？
　　 [NOR1的表達抑制HeLa細胞的生長并促進細胞凋亡]
　　 NOR1的表達明顯抑制HeLa細胞的生長及細胞軟瓊脂集落形成。通過生長曲線結合細胞計數(shù)觀察轉染空白載體及NOR1的HeLa細胞的生長情況，結果顯示NOR1過表達細胞的生長速度顯著低于轉染空白載體的細胞，同時形成的細胞集落明顯較少，并且集落的體積也明顯變小。NOR1使H

7、eLa細胞在增殖過程中DNA的復制受抑而阻滯于S期，并且增加細胞的凋亡。將NOR1的反義互補序列轉入HEK293細胞，通過透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)轉染細胞的核/漿比值增加的比例較對照細胞明顯增多。從上述結果說明，NOR1可以通過周期抑制和細胞凋亡來抑制宮頸癌細胞的生長，而在非腫瘤細胞中減少NOR1的表達可以增加細胞的惡性表型。
　　 [NOR1與細胞的代謝]
　　 將轉染空白載體及NOR1的HeLa細胞的總RNA與缺氧信號通路

8、微陣列(Oligo GEArray(R) Human Hypoxia Signaling Pathway Microarray:主要包含與缺氧應激相關的基因:應激反應相關基因、氧化還原酶類、缺氧相關轉錄調節(jié)因子以及輔因子、凋亡相關基因、缺氧相關的信號轉導基因等）雜交發(fā)現(xiàn)，NOR1的表達使HeLa細胞內大部分與缺氧相關的基因表達下調，唯一的上調基因是Bax，Bax參與凋亡的正向調節(jié)。在表達下調的基因中挑選己糖激酶基因(hexokinase

9、，HK2)、過氧物酶體增殖激活受體α(peroxisome proliferative activated receptorα，PPARA)以及缺氧誘導因子抑制劑(factor inhibit HIF1，F(xiàn)IH-1)，通過適時定量PCR驗證與微陣列的結果一致。HK2是糖酵解反應的第一個限速酶，它的下調意味著糖酵解過程受抑，而糖酵解功能減弱可以增加抗癌藥物的療效。PPARA調節(jié)脂肪酸代謝且與腫瘤的發(fā)生相關，微陣列結果示PPARA所調節(jié)的下

10、游基因:血管形成素樣蛋白4(angiopoietin-like protein4，ANGPTL4)和溶血磷脂酸?；D移酶2(1-acyl-n-glycerol3-phosphate acyltransferase2,AGPAT2)均下調，它們分別參與降糖、升脂以及甘油三脂合成代謝功能，同時兩個基因編碼的蛋白活性下降均可以誘發(fā)腫瘤細胞凋亡。FIH-1（又名HIFIAN）是一個Fe(Ⅱ)、2-氧戊二酸依賴的加雙氧酶，可以羥化HIF-1轉錄結

11、構域中的Asp803使其轉錄活性下降而備受關注，NOR1明顯下調FIH-1的表達，提示可能增加HIF-1的轉錄功能，但微陣列結果所示受HIF-1調節(jié)的下游基因表達并無改變，說明NOR1可能調節(jié)FIH-1作為氧化還原酶所參與的其他功能。
　　 [NOR1通過p53及內質網(wǎng)參與細胞凋亡]
　　 在缺氧誘導的凋亡中，p53起著非常重要的作用，而且p53通過抑制DNA的合成使細胞周期阻滯于S期。NOR1的表達使p53的表達上調，

12、同時HeLa細胞的凋亡比例以及被阻滯在S期的細胞明顯增加，說明由NOR1引起的凋亡中，p53同樣有著舉足輕重的作用。將綠色熒光標記的NOR1轉入HeLa細胞，用CoCl2、H2O2分別誘導后，發(fā)現(xiàn)兩種誘導都使NOR1在內質網(wǎng)上大量聚集，并出現(xiàn)在腫脹的線粒體內。同時分別檢測胞漿、線粒體的cytochrome C和caspase9的表達，兩個分子均由線粒體移至胞漿。微陣列結果顯示，Bax表達上調，BcL-2卻表達下調。內質網(wǎng)和線粒體在細胞的

13、凋亡過程中，都是非常重要的細胞器，許多調節(jié)和效應分子如:Ca2+、Bax、BcL-2等將兩者在細胞凋亡事件中緊密聯(lián)系在一起。研究者推測，NOR1引起的凋亡可能首先由內質網(wǎng)啟動凋亡，導致大量Ca2+的釋放，激活BcL-2家族成員Bax，同時BcL-2表達下降增加Ca2+從內質網(wǎng)的釋放，線粒體攝取后引起線粒體膜勢能下降，導致線粒體腫脹同時釋放cytochrome C和caspase9并激活caspase3等一系列凋亡效應分子，將凋亡的信號放