腫瘤細(xì)胞TRAIL-R1翻譯后修飾和TRAIL-誘導(dǎo)凋亡的敏感性.pdf

1、目的：
　　 用單淋巴細(xì)胞分析方法(ISAAC)方法,從TransChromo(TC)老鼠,提取出9種特異性結(jié)合人類TRAIL-R1的人免疫球蛋白G的單克隆抗體,并分類這9種TRAIL-R1特異性單克隆抗體,篩查抗體在TRAIL-R1相對(duì)應(yīng)的表位。進(jìn)一步,篩選對(duì)TRAIL治療敏感性較高的腫瘤細(xì)胞類型和TRAIL治療腫瘤較有效的細(xì)胞TRAIL-R1表位位點(diǎn)。探討TRAIL和TRAIL-R1的表位構(gòu)象和敏感性關(guān)系,幫助闡明TRAIL

2、誘導(dǎo)凋亡機(jī)制,為應(yīng)用TRAIL和TRAIL-R1信號(hào)靶向治療惡性腫瘤提供有用資料。
　　 方 法
　　 ELISA競(jìng)爭法分類TRAIL-R1特異性單克隆抗體以及該TRAIL-R1特異性抗體的可能表位。用流式細(xì)胞術(shù),在Colo205、K562、Daudi、KMP4、MCF7等14種腫瘤細(xì)胞上繼續(xù)分類和篩查TRAIL-R1特異性單克隆抗體在TRAIL-R1上的可能抗體表位。進(jìn)一步用細(xì)胞生存能力分析,篩選TRAIL-R1抗體表

3、位(TRl-272-、438-和419-表位),并選擇對(duì)于細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)的TRAIL-R1抗體表位。接著,激光共聚焦顯微鏡分析和驗(yàn)證,所篩選的TRAIL-R1抗體表位在TRAIL結(jié)合之后可能發(fā)生的變化。進(jìn)一步分析,各個(gè)細(xì)胞系TRAIL-R1 cDNA序列表達(dá)情況,檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞系TRAIL-R1的表達(dá)差異是否是因?yàn)楦鱾€(gè)細(xì)胞系TRAIL-R1堿基序列發(fā)生了變化。用衣霉素抑制各個(gè)腫瘤細(xì)胞TRAIL-R1的N-糖鏈或benzyl-α-GalN

4、Ac抑制腫瘤細(xì)胞合成O-糖鏈,繼續(xù)用流式細(xì)胞術(shù)分析各個(gè)細(xì)胞系抑制TRAIL-R1糖鏈后的細(xì)胞染色結(jié)果。我們用Mann-Whitney's U-檢驗(yàn)估計(jì)P值。
　　 結(jié) 果
　　 (1)ELISA競(jìng)爭法推測(cè)9種TRAIL-R1特異性單克隆抗體在TRAIL-R1結(jié)合表位,從TR1-272抗體,TR1-419抗體,TR1-404和TR1-416抗體,TR1-407、417.和422-抗體,TR1--412和438-抗體之間,完

5、全阻斷、部分阻斷或幾乎不阻斷等特點(diǎn)分析,推測(cè)出在重組體TRAIL-R1至少存在5種抗體表位。我們暫時(shí)將這些TRAIL-R1表位指定為TR1-272-、419-、416-、438-或417-表位。TR1-272-表位幾乎被其他抗體競(jìng)爭阻斷,除了TR1-438-抗體。而TR1-438-表位不能被TR1-272-抗體競(jìng)爭阻斷,而被TR1-416和417-抗體部分競(jìng)爭阻斷。TR1-416-表位被TR1-272-和419-抗體阻斷,而幾乎不被TR

6、1-417-和438-抗體阻斷。TR1-417表位幾乎不被TR1-272-、416-、419-和438-抗體阻斷。TR1-419表位幾乎被TR1-272抗體阻斷,被TR1-417-和416-抗體部分阻斷,而不被TR1-438抗體阻斷。
　　 (2)下一步ELISA競(jìng)爭法分析TRAIL-R1特異性單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)和在TRAIL-R1的TRAIL結(jié)合位點(diǎn)間的關(guān)系。結(jié)果顯示TRAIL阻斷TR1-417-和438-抗體和TRAIL-R

7、1表位的結(jié)合,而幾乎不阻斷TR1-416-、419-和272-抗體的與TRAIL-R1表位的結(jié)合。這些結(jié)果顯示,TR1-417-和438-表位位于TRAIL-結(jié)合位點(diǎn)或近處,TR1-272-、416-和419-表位可能位于TRAIL結(jié)合位點(diǎn)外側(cè)。從競(jìng)爭ELISA結(jié)果分析顯示,TR1-272和438-表位是相互遠(yuǎn)離的。而抗體結(jié)合TR1-416-、417-和438-表位,較少相互干擾,TR1-417-和272-表位和TR1-416-、419

8、-和272-表位是相互靠近的。
　　 (3)我們用流式細(xì)胞儀分析各個(gè)抗體在不同細(xì)胞系的結(jié)合情況。有趣的是,部分細(xì)胞系被TR1-404-、407-、416-、417-或422-抗體染色,而不被TR1-272-、419-、412-或438-抗體染色。這些結(jié)果證明,根據(jù)競(jìng)爭ELISA結(jié)果分類抗體,符合細(xì)胞結(jié)合模式分類,在各個(gè)細(xì)胞系細(xì)胞表面TRAIL-R1抗體表位表達(dá)是不同的。TR1-416和417-表位在所有細(xì)胞系表達(dá),表達(dá)TR1-4

9、16和417-表位的細(xì)胞系,不一定表達(dá)TR1-272、419-和438-表位。而有趣的是,Colo205、K562、Daudi和Du145細(xì)胞不表達(dá)TR1-272表位,而強(qiáng)烈表達(dá)其他抗體表位。
　　 (4)進(jìn)一步,我們檢測(cè)不同TRAIL-R1表位(TR1-272-、438-和419-表位)表達(dá)是否與TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞系凋亡的敏感度相關(guān)。其中TR1-272-表位缺失的Colo205、K562、Daudi和Dul45腫瘤細(xì)胞比T

10、R1-272-表位陽性的腫瘤細(xì)胞更容易被TRAIL誘導(dǎo)凋亡(p=0.0014)。與此對(duì)比,TR1-438-表位構(gòu)象和TRAIL誘導(dǎo)的凋亡不相關(guān)(p=0.41)。TR1-419表位構(gòu)象和TqLAIL誘導(dǎo)的凋亡也顯示不相關(guān)。我們觀察到一些抗體包括TR1-416抗體和TR1-419抗體,不和TRAIL競(jìng)爭結(jié)合TRAIL-R1在這里,我們又檢測(cè)了TRAIL和TR1-416抗體聯(lián)合誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。分析結(jié)果顯示,TR1-416抗體明顯增強(qiáng)了TRA

11、IL對(duì)于誘導(dǎo)Colo205、K562和Daudi等腫瘤細(xì)胞的凋亡作用?？傊?這些結(jié)果顯示TR1-272抗體能夠預(yù)測(cè)TRAIL在臨床,用TRAIL治療腫瘤時(shí)的敏感性。TR1-416抗體能夠增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)部分腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。
　　 (5)為了解TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的不同敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制,在TR1-272-表位陰性或陽性細(xì)胞系用TRAIL處理后,用激光共聚焦顯微鏡分析了細(xì)胞表面TRAIL-R1的情況。激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯

12、示,TRAIL作用后的TR1-272-表位陰性細(xì)胞,TRAIL-R1形成了大聚束,而TR1-272陽性細(xì)胞不能形成聚束。顯示,TRAIL-R1寡聚化作用以及TR1-272-表位構(gòu)象,可能影響腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性。
　　 (6)進(jìn)一步分析各個(gè)細(xì)胞系TRAIL-R1 cDNA序列表達(dá)發(fā)現(xiàn),各個(gè)細(xì)胞系的TRAIL-R1氨基酸序列基本相同,因此說明各個(gè)細(xì)胞系表位表達(dá)差異不是發(fā)生在基因水平。(7)下一步繼續(xù)分析TR

13、AIL-R1的翻譯后糖鏈修飾。在各個(gè)細(xì)胞,用衣霉素抑制TRAIL-R1的N-糖鏈或Benzyl-α-GaiNAc抑制合成O-糖鏈,繼續(xù)用流式細(xì)胞術(shù)分析,是否各個(gè)細(xì)胞系TR1-272、419-或438-表位是否被蛋白質(zhì)翻譯后糖鏈修飾后出現(xiàn)了陰性或陽性染色表達(dá)。結(jié)果顯示,O-糖鏈或N-糖鏈的抑制未能改變陰性表達(dá)率。觀察到糖鏈對(duì)于TRAIL-R1表位的構(gòu)象無影響,提示糖鏈可能對(duì)表位構(gòu)象不起關(guān)鍵作用。
　　 結(jié) 論
　　 TR1

14、-272-抗體可能識(shí)別TRAIL-R1構(gòu)象,而這些構(gòu)象能釋放強(qiáng)大的細(xì)胞死亡信號(hào)。與此對(duì)比,TR1-438-、TR1-419-、TR1-416和TR1-417-表位構(gòu)象與TRAIL誘導(dǎo)的凋亡不相關(guān)。TR1-416抗體能夠明顯增強(qiáng)TRAIL對(duì)于誘導(dǎo)Colo205、K562和Daudi等腫瘤細(xì)胞的凋亡作用。各個(gè)細(xì)胞系TRAIL-R1表位表達(dá)差異不是發(fā)生在基因水平,而TRAIL-R1翻譯后糖鏈修飾可能對(duì)表位構(gòu)象不起關(guān)鍵作用。進(jìn)一步分析TRAIL