MAGE-A3基因沉默對肝癌化療藥物敏感性的影響及凋亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、【背景與目的】
　　肝細(xì)胞癌（hepatocellsular carcinoma，HCC))是一種惡性程度高、預(yù)后差的常見腫瘤。治療早期肝癌最為有效的方式是手術(shù)切除，但藥物的化療仍是中晚期肝癌患者重要的輔助治療手段。黑色素瘤抗原(melanoma antigen gene，MAGE）在正常組織中僅表達(dá)于睪丸和胎盤中，而在各種腫瘤組織中高表達(dá)，與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后及耐藥相關(guān)?；瘜W(xué)合成MAGE-A3 siRNA小干擾片段

2、，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2及Huh-7，加入化療藥物處理，觀察MAGE-A3沉默后對人肝癌細(xì)胞株 HepG2、Huh-7化療藥物敏感性的影響，并初步闡明相關(guān)的分子機(jī)制，探討MAGE-A3基因在人肝細(xì)胞癌化療藥物治療過程中所起的作用，為臨床尋找提高肝癌化療藥物敏感性的方法奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1.培養(yǎng)表達(dá)MAGE-A3的人肝癌細(xì)胞株HepG2（P53野生型）和Huh-7（P53突變型），化療藥順鉑（Cisplatin

3、,DDP）和阿霉素（Adriamycin,ADM）處理后，實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞生長情況，采用Q-PCR和Western Blot檢測加藥前后兩種細(xì)胞中MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表達(dá)情況。
　　2.針對MAGE-A3 mRNA體外化學(xué)合成siRNA，采用RNAi-Mate瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2，Huh-7細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分空轉(zhuǎn)組（僅加轉(zhuǎn)染試劑）、陰性對照組（加不相關(guān)小RNA）和MAGE-A3 siRNA干擾組（干擾組），倒置

4、熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，用Q-PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表達(dá)情況。
　　3.在MAGE-A3基因沉默的肝癌細(xì)胞中加入不同濃度的化療藥，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長抑制情況，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration50，IC50)，比較MAGE-A3 siRNA轉(zhuǎn)染前后肝癌細(xì)胞對化療藥物敏感性的變化，觀察其變化是否通過MAGE-A3表達(dá)下調(diào)起作

5、用。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測化療藥物作用前后肝癌細(xì)胞凋亡情況和細(xì)胞周期的改變，了解MAGE-A3基因沉默后肝癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的變化。
　　5.MAGE-A3基因沉默前后，Q-PCR和Western Blot技術(shù)比較化療藥物處理的肝癌細(xì)胞中P53、Bcl-2、Bax、survivin、caspase3和caspase9基因的表達(dá)情況。
　　【結(jié)果】
　　1. HepG2、Huh-7細(xì)胞表達(dá)MAGE-A3，加入D

6、DP和ADM處理后，HepG2、Huh-7細(xì)胞MAGE-A3的表達(dá)隨著藥物劑量的增加和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。
　　2.MAGE-A3 siRNA664片段轉(zhuǎn)染HepG2、Huh-7細(xì)胞24h、48h、72h，Q-PCR檢測結(jié)果顯示MAGE-A3基因的表達(dá)受到顯著抑制，以轉(zhuǎn)染后48h效果最佳，沉默效率達(dá)70％以上。Western Blot檢測也證實(shí)該片段轉(zhuǎn)染48h后兩株細(xì)胞的MAGEA3蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　3.MTT檢

7、測結(jié)果顯示：DDP、ADM分別作用于HepG2、Huh-7細(xì)胞24h、48h、72h后，細(xì)胞的生長受到抑制，顯示劑量依賴性和時(shí)間依賴性。轉(zhuǎn)染MAGE-A3 siRNA后，HepG2細(xì)胞對DDP、ADM的敏感性分別提高1.57倍、2.15倍，差別有顯著意義（P<0.05），而 Huh-7細(xì)胞對 DDP、ADM的敏感性分別提高1.22倍、1.21倍，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有差異（P<0.05）。
　　4.Annexin V檢測HepG2、Huh-

8、7細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示：在不加化療藥物處理的情況下，HepG2細(xì)胞干擾組細(xì)胞凋亡率顯著增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而 Huh-7細(xì)胞干擾組與對照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無明顯差異(P>0.05)。加入DDP、ADM處理后，HepG2、 Huh-7細(xì)胞干擾組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示沉默MAGE-A3能夠增強(qiáng)DDP、ADM對HepG2、Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，以HepG2細(xì)胞為顯著。

9、r>　　5.碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)檢測HepG2、Huh-7細(xì)胞周期，結(jié)果顯示：MAGE--A3沉默后，兩株細(xì)胞易阻滯于G2期；加入DDP處理，干擾組與對照組比較，HepG2、Huh-7細(xì)胞易阻滯于S期，加入ADM處理，干擾組與對照組比較，HepG2、Huh-7細(xì)胞易阻滯于G2期。
　　6.Q-PCR和Western Blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)因子，結(jié)果顯示：下調(diào) MAGE-A3后，加入DDP、ADM處理，H

10、epG2細(xì)胞中P53、Bax、caspase3、caspase9表達(dá)增加，而Bcl-2、survivin表達(dá)下降，提示MAGE-A3沉默增強(qiáng)HepG2細(xì)胞化療藥物細(xì)胞毒作用的可能機(jī)制是誘導(dǎo) P53依賴的細(xì)胞凋亡通路；而 Huh-7細(xì)胞中突變型P53表達(dá)下降同時(shí)伴有Bax表達(dá)增加及survivin表達(dá)下降，但與Bcl-2、caspase3、caspase9的變化無相關(guān)性。提示MAGE-A3沉默影響Huh-7細(xì)胞化療藥物細(xì)胞毒作用可能涉及非