紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)多倍體的形成機(jī)制及對藥物敏感性的影響——凋亡通路的初步研究.pdf

1、目的:
　　 腫瘤的化療是腫瘤綜合治療的重要組成部分。許多研究表明,化學(xué)藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡達(dá)到治療目的,能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為評價(jià)抗癌藥物療效的重要標(biāo)志,但許多化療藥物都面臨著腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的問題。目前的研究多集中在多藥耐藥基因的表達(dá)與腫瘤耐藥間的關(guān)系,但有研究顯示多倍體腫瘤對常用的放療、化療極不敏感,而具有多倍體亞克隆的腫瘤預(yù)后更差。紡錘絲毒性藥物(紫杉醇/長春新堿/Nocodazole)是許多腫瘤化療的一線藥

2、物。由此提示我們這些紡錘絲毒性藥物誘導(dǎo)形成的多倍體很可能與腫瘤耐藥發(fā)生相關(guān)。
　　 通常正常細(xì)胞周期進(jìn)程中如出現(xiàn)異常(如形成多倍體)會啟動凋亡通路。即使腫瘤細(xì)胞也存在多種正常的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn),在用紡錘絲毒性藥物處理細(xì)胞時(shí),有些細(xì)胞以發(fā)生凋亡為主,有些細(xì)胞以形成多倍體為主。為何一些細(xì)胞會出現(xiàn)有絲分裂滑動而導(dǎo)致多倍體(四倍體)的產(chǎn)生?為何這些多倍體細(xì)胞未激活細(xì)胞凋亡機(jī)制?分析起來可能與細(xì)胞周期的失調(diào)控和細(xì)胞凋亡通路受

3、到抑制有關(guān)。
　　 Bcl-2家族是哺乳動物細(xì)胞中調(diào)節(jié)凋亡的重要因子,目前研究認(rèn)為Bcl-2基因及其相關(guān)蛋白高表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡是腫瘤發(fā)生和產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象的重要因素之一。因此,從凋亡的角度出發(fā)對Bcl-2、Bax在Nocodazole誘導(dǎo)多倍體腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行研究有較大的意義。
　　 是否凋亡通路的異常是導(dǎo)致多倍體形成的真正因?yàn)槟?又是那些分子在控制著凋亡通路呢?本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用細(xì)胞有絲分裂阻滯劑Nocodazole為誘導(dǎo)

4、物,以兩株對該藥反應(yīng)截然不同的乳腺癌細(xì)胞為研究對象(一株MDA-MB-231以形成多倍體細(xì)胞為特點(diǎn),一株Hoc1806以凋亡為特點(diǎn)),在與藥物共同孵育的不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞,確定細(xì)胞周期并檢測細(xì)胞凋亡通路蛋白Bcl-2/Bax在Nocodazole誘導(dǎo)多倍體腫瘤形成中的表達(dá),并初步探討了其可能的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、實(shí)驗(yàn)分組:用Nocodazole處理兩株乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和HCC1806在藥物

5、作用后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h,根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞,并以不加藥細(xì)胞為空白對照。
　　 2、細(xì)胞周期的檢測:PI染色流式細(xì)胞儀檢測Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞周期阻滯的影響,進(jìn)行細(xì)胞周期分析,確定細(xì)胞周期。
　　 3、細(xì)胞凋亡的檢測:倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡下分別觀察MDA-MB-231和HCC1806對照組,及Nocodazole處理后不同時(shí)間點(diǎn)收獲的MD

6、A-MB-231和HCC1806細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化；PI染色流式細(xì)胞儀檢測Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞凋亡的影響；WestenBlot檢測細(xì)胞凋亡執(zhí)行分子caspase9,caspase3的剪切情況。
　　 4、蛋白質(zhì)印跡法檢測MDA-MB-231和HCC1806對照組,及Nocodazole處理后不同時(shí)間點(diǎn)收獲的MDA-MB-231細(xì)胞和HCC1806細(xì)胞中Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2和

7、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞周期的影響流式結(jié)果顯示,Nocodazole作用HCC1806后以凋亡為特點(diǎn)；MDA-MB-231細(xì)胞在接觸該類藥物6h開始出現(xiàn)G2/M期停滯,24h完全停滯在G2/M期,24h后多倍體形成增多,72h以多倍體為主。
　　 2、Nocodazole對MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞凋亡的影響No

8、codazole作用MDA-MB-231和HCC1806細(xì)胞6h后,細(xì)胞開始變圓,24h后細(xì)胞全部變圓,HCC1806細(xì)胞隨著接觸藥物時(shí)間的延長,細(xì)胞體積逐漸變小、變形,胞核皺縮,細(xì)胞漂浮,凋亡小體形成等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,這類細(xì)胞隨著與藥物接觸時(shí)間延長逐漸增多,72h后以凋亡小體形成為主；而MDA-MB-231細(xì)胞隨著接觸藥物時(shí)間的延長,出現(xiàn)細(xì)胞體積增大,細(xì)胞核大等典型的多倍體形態(tài)學(xué)變化的細(xì)胞逐漸增多,72h后以多倍體形成為主。We

9、stenBlot結(jié)果顯示,HCC1806細(xì)胞在藥物作用24h出現(xiàn)凋亡標(biāo)志蛋白caspase9、Caspase3的表達(dá),MDA231未檢測出caspase9、caspase3的表達(dá)。
　　 3、MDA-231和HCC1806細(xì)胞中Bcl-2/Bax蛋白的表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示,Bax蛋白在HCC1806細(xì)胞中持續(xù)表達(dá),藥物作用36h、48h時(shí)表達(dá)量明顯增加；Bcl-2在HCC1806細(xì)胞中亦有表達(dá),24h后表達(dá)增加,bcl-2/