eIF4E對食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　食管癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。大量研究發(fā)現(xiàn)，真核細胞翻譯起始因子4E(eukaryotictranslation initiation factor4E,eIF4E)在惡性腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移行為中的發(fā)揮重要作用。eIF4E能特異性地結(jié)合mRNA5'端m7GpppN帽子結(jié)構(gòu)，是真核細胞胞質(zhì)中mRNA翻譯有效的限速調(diào)節(jié)因子，一旦被激活，該基因通過提高許多癌基因相關(guān)的生長因子的翻譯表達而促

2、進致癌作用。近年來的研究證實，eIF4E在包括食管癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤及其癌旁組織中過表達，eIF4E逐漸成為評估和判定食管癌惡性程度的重要基因，調(diào)節(jié)eIF4E的水平和活性，抑制腫瘤細胞生長，是腫瘤生物治療學(xué)領(lǐng)域的新思路，但目前有關(guān)eIF4E與食管癌化療藥物敏感性的作用機制研究報道較少。本研究擬以脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞，通過RANi技術(shù)調(diào)控食管癌EC9706細胞中eIF4E的表達，篩選出穩(wěn)定表達的食管癌細胞，MTT法

3、研究調(diào)控真核細胞翻譯起始因子4E的表達探討與食管癌相關(guān)藥物敏感性的關(guān)系，為進一步探索篩選食管癌的靶向治療提供依據(jù)。
　　方法:
　　1、篩選RNA干擾有效靶點:將eIF4E的過表達質(zhì)粒PEGFP-N1和eIF4E不同干擾靶點的RNAi病毒載體質(zhì)粒U6-shRNA-CMV-GFP-1、U6-shRNA-CMV-GFP-2、U6-shRNA-CMV-GFP-3,通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染工具細胞293T細胞，24h后熒光顯微鏡下觀測綠色熒

4、光蛋白(GFP)的表達情況，36h后收集細胞抽提蛋白，采用Western Blot檢測eIF4E的表達情況，實驗結(jié)果通過Leica ApplicationSuite4.0軟件進行灰度值分析，通過計算eIF4E與GAPDH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量。判斷不同靶點的干擾效果，選擇干擾效果最強的RNAi病毒載體質(zhì)粒用于實驗。
　　2、建立eIF4E不同表達水平的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株:將PEGFP-N1質(zhì)粒、U6-shR

5、NA-CMV-GFP質(zhì)粒（篩選出的干擾效果最強的質(zhì)粒）及陰性對照PEGFP-N1-NC質(zhì)粒、U6-shRNA-CMV-GFP-NC質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染到食管癌EC9706細胞中，并用G418抗生素進行抗性篩選、擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株eIF4E-shRNA細胞（eIF4E沉默）、eIF4E-OE細胞（eIF4E過表達）、eIF4E-OE-NC細胞（eIF4E過表達空載）、eIF4E-shRNA-NC細胞（eIF4E沉默空載）。<

6、br>　　3、通過Real Time PCR和Western Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平對各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株進行鑒定:Real Time PCR檢測各組細胞eIF4E mRNA表達水平，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法分析Ct(Cyclethreshold)值，最后得出的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的相對表達水平。Western Blot檢測各組細胞蛋白質(zhì)的表達水平，實驗結(jié)果通過Leica Application Suite4.0軟件

7、進行灰度值分析，通過計算eIF4E與GAPDH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量。
　　4、MTT法測定各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的化療藥物敏感性:4種不同濃度的化療藥物順鉑(DDP)、氟尿嘧啶(FU)、紫杉醇(TAX)，分別作用24h、48h后，用MTT法檢測藥物對eIF4E-shRNA細胞(eIF4E沉默)、eIF4E-OE細胞（eIF4E過表達）、eIF4E-OE-NC細胞(eIF4E過表達空載)、eIF4E-shR

8、NA-NC細胞（eIF4E沉默空載）、EC9706細胞的生長抑制率。
　　結(jié)果:
　　1、質(zhì)粒U6-shRNA-CMV-GFP-1、U6-shRNA-CMV-GFP-2、U6-shRNA-CMV-GFP-3、U6-shRNA-CMV-GFP-NC分別與PEGFP-N1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細胞后，熒光倒置顯微鏡下觀察到各組細胞均發(fā)出綠色熒光。通過Leica Application Suite4.0軟件分析Western Blo

9、t檢測各組eIF4E和內(nèi)參GAPDH的電泳條帶，計算eIF4E與GAPDH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量，分別為0.31、0.11、0.44、0.52。
　　2、不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EC9706細胞:不同質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞后，熒光倒置顯微鏡下觀察到eIF4E過表達細胞、eIF4E沉默細胞、eIF4E過表達空載細胞、eIF4E沉默空載細胞均發(fā)出綠色熒光。
　　3、Real Time PCR檢測eIF

10、4E mRNA表達水平結(jié)果:得出的數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法計算EC9706細胞、eIF4E過表達EC9706細胞、eIF4E過表達空載EC9706細胞、eIF4E沉默EC9706細胞、eIF4E沉默空載EC9706細胞的mRNA的相對表達水平，分別為1.00、3.54、1.04、0.37、0.96。
　　4、Western Blot檢測eIF4E蛋白質(zhì)表達水平結(jié)果:通過LeicaApplication Suite4.0軟件分析EC97

11、06細胞、eIF4E過表達EC9706細胞、eIF4E過表達空載EC9706細胞、eIF4E沉默EC9706細胞、eIF4E沉默空載EC9706細胞的eIF4E和內(nèi)參GAPDH的電泳條帶的灰度值，計算eIF4E與GAPDH的灰度值比值得到各組細胞eIF4E蛋白的相對表達量分別為0.97、1.54、1.01、0.45、1.04。
　　5、MTT檢測結(jié)果:1）在同一時間點(24h、48h)，隨著三種化療藥物濃度的逐漸增加，EC9706

12、細胞、eIF4E過表達EC9706細胞、eIF4E過表達空載EC9706細胞、eIF4E沉默EC9706細胞、eIF4E沉默空載EC9706細胞的生長抑制率逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);2)同一藥物濃度作用于5種細胞48h與24h相比，生長抑制率均逐漸逐漸升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);3)相同時間點、相同藥物濃度，5種細胞對相同藥物的生長抑制率不同，eIF4E過表達EC9706細胞與eIF4E過表達空載EC970

13、6細胞、EC9706、eIF4E沉默EC9706細胞相比，生長抑制率均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);eIF4E沉默EC9706細胞與eIF4E沉默空載EC9706細胞、EC9706、eIF4E過表達EC9706細胞相比，生長抑制率均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、成功篩選出RNA干擾效果最強的U6-shRNA-CMV-GFP-2質(zhì)粒。
　　2、建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的細胞株:eIF

14、4E過表達EC9706細胞、eIF4E過表達空載EC9706細胞、eIF4E沉默EC9706細胞及eIF4E沉默空載EC9706細胞。
　　3、隨著順鉑、氟尿嘧啶、紫杉醇的藥物濃度的升高，eIF4E過表達EC9706細胞、eIF4E過表達空載EC9706細胞、eIF4E沉默EC9706細胞及eIF4E沉默空載EC9706細胞及EC9706細胞的生長抑制率隨之升高;不同濃度的三種化療藥物作用于5種細胞48h的細胞生長抑制率高比24h