阻抑骨髓基質(zhì)SDF-1作用對(duì)HL-60細(xì)胞增殖、凋亡及藥物敏感性的影響.pdf

1、目的:髓內(nèi)殘留病變是急性白血病緩解后復(fù)發(fā)的根源.但是,來源于骨髓基質(zhì)的信號(hào)如何影響髓內(nèi)殘留白血病細(xì)胞,其機(jī)制目前還不清楚.近年來研究發(fā)現(xiàn),基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)是骨髓基質(zhì)細(xì)胞生成、分泌的一種重要的趨化因子,其唯一的受體CXCR<,4>是造血干細(xì)胞和白血病細(xì)胞表面有不同程度的表達(dá),二者的結(jié)合在白血病細(xì)胞的移動(dòng)、生存和凋亡以及造血干細(xì)胞動(dòng)員和歸巢等方面發(fā)揮極其重要的作用

2、.因此,通過干預(yù)SDF-1/CXCR<,4>系統(tǒng)能否影響白血病細(xì)胞在骨髓內(nèi)的生存、增殖及凋亡,同時(shí)白血病骨髓內(nèi)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性是否發(fā)生改變,如何變化等問題,目前國內(nèi)外尚缺乏系統(tǒng)性研究.該實(shí)驗(yàn)通過研究SDF-1/CXCR<,4>系統(tǒng)與白血病細(xì)胞之間的關(guān)系,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)微小殘留病變的形成機(jī)制,并為尋找通過改造白血病骨髓微環(huán)境逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥治療白血病的新的治療方法提供理論基礎(chǔ).方法:該實(shí)驗(yàn)中,收集13例正常及14例白血病骨髓標(biāo)本,分離

3、骨髓單個(gè)核細(xì)胞,采用Dexter型貼壁細(xì)胞長期培養(yǎng)體系培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞,待基質(zhì)細(xì)胞融合成層后,與急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞共培養(yǎng).該研究分成實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,對(duì)照組只加入等量培養(yǎng)液,實(shí)驗(yàn)組加入10μg/ml抗CXCR<,4>的單克隆抗體12G5以阻斷SDF-1的生物學(xué)作用,12G5加入時(shí)間與共培養(yǎng)時(shí)間一致,在不同時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)下述指標(biāo).(1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL-60細(xì)胞膜表面CXCR<,4>的表達(dá).(2)ELISA法檢測(cè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞

4、培養(yǎng)上清中SDF-1的含量.(3)倒置顯微鏡下觀察HL-60細(xì)胞在骨髓基質(zhì)層上的粘附情況并計(jì)算粘附率.(4)臺(tái)盼藍(lán)排染法測(cè)定HL-60細(xì)胞的存活率并繪制細(xì)胞生長曲線.(5)流式細(xì)胞儀測(cè)定HL-60細(xì)胞增殖周期及凋亡率.(6)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HL-60細(xì)胞原癌基因BCL-2、凋亡基因Fas及細(xì)胞增殖核抗原PCNA的表達(dá).(7)培養(yǎng)體系中加入不同濃度化療藥物孵育,MTT染色,分光光度計(jì)測(cè)定不同時(shí)相點(diǎn)A<,540>值,繪制藥物殺傷效應(yīng)曲線

5、,同時(shí)在形態(tài)學(xué)上觀察化療藥物Ara-C對(duì)HL-60細(xì)胞殺傷效應(yīng)的變化.結(jié)論:(1)HL-60細(xì)胞表面中等程度表達(dá)CXCR<,4>,具有12G5作用的生物學(xué)基礎(chǔ).(2)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞能分泌相當(dāng)量的SDF-1,在白血病基質(zhì)尤為顯著,提示SDF-1的高分泌參與形成白血病骨髓微環(huán)境的功能異常.(3)10μg/ml 12G5能有效阻抑骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中SDF-1的活性.(4)白血病骨髓基質(zhì)比正?；|(zhì)具有更強(qiáng)的粘附HL-60細(xì)胞的作用.

6、(5)SDF-1活性受到抑制后,HL-60細(xì)胞的粘附率、活細(xì)胞率及PCNA表達(dá)下降,而且,進(jìn)入靜止期的HL-60細(xì)胞比例增高,提示SDF-1活性受到抑制后白血病細(xì)胞增殖受抑.(6)SDF-1活性被抑制后,HL-60細(xì)胞凋亡率增加,Fas蛋白表達(dá)上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),提示SDF-1活性抑制促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡.(7)SDF-1活性受抑后,雖然Ara-C對(duì)HL-60細(xì)胞的早期殺傷作用減弱,但HL-60細(xì)胞耐藥出現(xiàn)延緩,化療藥物殺傷時(shí)間