養(yǎng)殖大菱鲆波豆蟲的分離培養(yǎng)、敏感性藥物分析及分子鑒定.pdf

1、魚波豆蟲(Ichthyobodo necator)隸屬于鞭毛綱(Class flagellates)，動基體目(Order Kinetoplastida)，是主要的魚類體外寄生蟲之一，廣泛寄生于全球范圍內(nèi)的多種養(yǎng)殖淡水魚類，嚴重危害著世界魚類養(yǎng)殖業(yè)。近年來，世界各地在一些嚴格意義的海水魚類上都發(fā)現(xiàn)了與魚波豆蟲非常相似的鞭毛蟲類寄生蟲。這表明魚波豆蟲病可能不僅僅只是一個種的鞭毛類原生動物引起的。我國關于魚波豆蟲病的研究多集中在淡水養(yǎng)殖魚類

2、的疾病防治方面，海水養(yǎng)殖魚類感染魚波豆蟲病的事例鮮有報道及研究。本研究此次在山東濰坊地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆(Scophthalmusmaximus)苗種上發(fā)現(xiàn)的魚波豆蟲病，是我國魚波豆蟲病在養(yǎng)殖大菱鲆上的首次報道。鑒定此次大菱鲆寄生蟲病病原并進行相應的初步研究，可以為我國海水養(yǎng)殖魚類感染魚波豆蟲病的研究積累一定的基礎資料并為我國大菱鲆(Scophthalmusmaximus)養(yǎng)殖中魚波豆蟲病的防治提供理論參考。
　　 本研究共分四個部分

3、：通過現(xiàn)場調(diào)查，顯微觀察和掃描電鏡觀察等基礎診斷方法對大菱鲆魚波豆蟲病進行初步診斷并得到其病原的形態(tài)學特征；利用原生動物微量分離方法成功分離出大菱鲆魚波豆蟲病病原并進行實驗室培養(yǎng)條件初步探索；選取四種常用魚病治療藥物進行魚波豆蟲敏感藥物篩選試驗；設計魚波豆蟲特異性引物進行PCR分子擴增反應，結合序列比對構建魚波豆蟲中國株的系統(tǒng)進化樹。
　　 1.養(yǎng)殖大菱鲆感染波豆蟲病癥及病原觀察。分別利用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡進行大菱鲆魚波

4、豆蟲病病原形態(tài)學觀察與分析并得到了中國區(qū)系以大菱鲆苗種為宿主的病原形態(tài)學顯微照片，分析其形態(tài)學特征，確定此次我國北方濰坊地區(qū)大菱鲆苗種爆發(fā)的寄生蟲病病原為魚波豆蟲(Ichthyobodo necator)。同時通過對山東半島其他海水魚類寄生蟲的調(diào)查發(fā)現(xiàn)了三種其他寄生蟲，分別為：盾纖毛蟲、淀粉卵渦鞭蟲和一種未定種纖毛蟲。
　　 2.利用原生動物微量分離方法成功分離出病原魚波豆蟲，篩選魚波豆蟲實驗室培養(yǎng)最佳培養(yǎng)條件。結果得出0.3g

5、/L牛肉浸膏培養(yǎng)液中，魚波豆蟲能夠很快進入指數(shù)增長期，種群密度達到一個較高值，但持續(xù)時間不長，很快進入衰退期。魚波豆蟲在1％的魚鰓組織勻漿上清培養(yǎng)液(EG培養(yǎng)液)中培養(yǎng)96h時，種群密度達到所有實驗組中的最高種群密度，達到了450000ind/mL且在4天內(nèi)種群密度都保持在較高密度水平，種群在10天內(nèi)都保持在一個較為理想的生存狀態(tài)，且種群自然增長率明顯高于牛肉浸膏培養(yǎng)液試驗組。因此實驗室長時間維持培養(yǎng)選擇1％的魚鰓組織勻漿上清培養(yǎng)液較為

6、理想。不同溫度、鹽度條件下，中國區(qū)系魚波豆蟲生長情況結果顯示：魚波豆蟲在4-30℃均可生存，22℃為其最佳生長繁殖溫度。鹽度對魚波豆蟲生長繁殖影響不顯著，但本試驗中的魚波豆蟲在淡水環(huán)境中并未能正常生長。
　　 3.試驗使用的四種常用藥物硫酸銅、硫酸銅-硫酸亞鐵合劑、高錳酸鉀和福爾馬林對魚波豆蟲都具有一定的滅殺效果，但綜合多種因素考慮，高錳酸鉀作為常用的滅菌劑，具有無殘毒無副作用，無異味施用方便，價格低廉等優(yōu)點，因此在治療大菱鲆魚

7、波豆蟲病時可優(yōu)先考慮。
　　 4.利用PCR擴增技術以中國山東濰坊地區(qū)大菱鲆苗種上的魚波豆蟲病原DNA為模板，進行分子生物學鑒定。鑒定結果顯示：本次中國海水魚類身上發(fā)現(xiàn)的魚波豆蟲與多個國家不同種魚波豆蟲都具有較高相似度。通過將本實驗對象與選取的14株不同國家不同宿主的魚波豆蟲序列比對分析進行系統(tǒng)發(fā)育研究后發(fā)現(xiàn)：中國地區(qū)以大菱鲆苗種為宿主的魚波豆蟲在親緣關系上與巴西國王黑鯛上寄生的魚波豆蟲同屬一枝，與美國鱸屬類上寄生的和劍尾魚上寄