臨床常見曲霉菌體外藥物敏感性及分子生物學(xué)鑒定方法研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、[目的]探討臨床常見曲霉菌(煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉)對(duì)經(jīng)典的抗真菌藥物伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B和新的抗真菌藥物泊沙康唑、卡泊芬凈的體外敏感性:建立應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)將臨床常見曲霉菌鑒定至種的水平。
   [方法]對(duì)所收集的真菌通過形態(tài)學(xué)和/或分子生物學(xué)鑒定,采用濃度梯度法(E-test)測(cè)定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈對(duì)5種曲霉菌的最低抑菌濃度(MIC);采用液氮研磨、試劑盒純化

2、方法提取曲霉菌細(xì)胞核DNA,普通PCR方法擴(kuò)增5種(47株)曲霉菌的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS),測(cè)序獲得ITS區(qū)序列,基于不同種曲霉菌的ITS區(qū)序列對(duì)種特異性探針進(jìn)行驗(yàn)證和改進(jìn),建立實(shí)時(shí)熒光PCR方法將常見曲霉菌通過特異性探針解鏈溫度(Tm)的差異進(jìn)行區(qū)分并對(duì)該方法的靈敏度、特異性及重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
   [結(jié)果]形態(tài)學(xué)觀察基本上能將臨床常見的5種曲霉菌鑒定到種,對(duì)于其他種屬形態(tài)學(xué)可以將其鑒定到屬的水平,但是較難鑒定到種??ú捶覂魧?duì)

3、煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉的MIC90均為0.094μg/ml,對(duì)黑曲霉的MIC90為0.19μg/ml,在5種藥物中最低;泊沙康唑?qū)ν燎沟腗IC90最低,為0.094μg/ml;對(duì)于煙曲霉和黃曲霉,MIC90由低到高依次為卡泊芬凈、泊沙康唑、伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B;土曲霉對(duì)兩性霉素B的MIC均>32μg/ml。MasterPureTM Yeast DNA Purification Kit提取的DNA量很低,固體培養(yǎng)+液氮研磨方

4、法、液體培養(yǎng)+液氮研磨方法以及固體培養(yǎng)+液氮研磨+試劑盒純化方法提取的DNA OD260/OD280的均值分別為1.73、1.96和1.80。煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉種特異性探針Tm值分別為61.4℃、57.4℃、67.7℃、65.8℃,土曲霉特異性探針的Tm值為64.5℃和55.2℃。實(shí)時(shí)熒光PCR方法對(duì)煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉的檢測(cè)下限分別為56.8fg、1110fg、13.7fg、123fg、780fg。疣

5、狀瓶霉和小孢根霉能與煙曲霉特異性探針發(fā)生交叉反應(yīng)。該方法在每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中Tm值的波動(dòng)在0.5℃以內(nèi)。
   [結(jié)論]形態(tài)學(xué)結(jié)合rDNAITS區(qū)測(cè)序?qū)φ婢N的鑒定很有幫助。Etest法體外藥敏結(jié)果顯示,新的棘白素類抗真菌藥物卡泊芬凈對(duì)五種曲霉具有很好的體外抗菌活性,唑類藥物對(duì)于曲霉菌的體外抗菌活性優(yōu)于兩性霉素B。采用固體培養(yǎng)+液氮研磨法+試劑盒純化法能獲得高純度的曲霉菌DNA。實(shí)時(shí)熒光PCR方法具有很好的靈敏度、特異性和重復(fù)性,能

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