構(gòu)建RNA結(jié)合蛋白表達(dá)文庫并研究其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming Growth Factor-β或者TGF-β）作為一種重要的細(xì)胞因子在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化中發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用。因此，TGF-β信號(hào)通路的調(diào)控異常與人類多種疾病密切相關(guān)如癌癥等。在TGF-β信號(hào)傳遞過程中Smads蛋白發(fā)揮了重要的作用。Smads家族蛋白根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能可以分為三大類，分別是受體激活的R-Smads（如Smad2/3），通用轉(zhuǎn)導(dǎo)的Co-Smad，以及抑制型的I-Smad

2、s。在經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路中，配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而引起R-Smads的磷酸化。磷酸化的R-Smads與Co-Smad結(jié)合形成三聚體進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到特定的DNA序列從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。
　　在TGF-β信號(hào)通路中，轉(zhuǎn)錄水平的研究已經(jīng)比較清楚，但是轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制還不是非常清晰?；蛟谵D(zhuǎn)錄后，需要經(jīng)過剪接加工成為成熟的mRNA，最后翻譯成為蛋白質(zhì)。經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄后剪接加工調(diào)控主要是通過RNA結(jié)合蛋白識(shí)別mRNA上的

3、增強(qiáng)或抑制單元來實(shí)現(xiàn)的。在TGF-β信號(hào)通路中，RNA結(jié)合蛋白如何參與其轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的機(jī)制還不清晰。本研究擬以構(gòu)建RNA結(jié)合蛋白文庫為載體，結(jié)合細(xì)胞水平和分子水平的實(shí)驗(yàn)，研究RNA結(jié)合蛋白在TGF-β信號(hào)通路中的調(diào)控作用。
　　根據(jù)RNA結(jié)合蛋白數(shù)據(jù)庫中的信息，在人類細(xì)胞中有235個(gè)蛋白含有一個(gè)或多個(gè)RNA結(jié)合單元（RNA Recognition Motif或者RRM）。對(duì)照cDNA文庫(HumanORFeome5.1)，我們獲得了

4、112個(gè)RNA結(jié)合蛋白的cDNA。通過Gateway系統(tǒng)，我們將文庫中的cDNA成功構(gòu)建到慢病毒載體上，并在293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)檢測(cè)，其中86個(gè)可以正確表達(dá)蛋白。然后我們利用TGF-β熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)SBE-luc在HaCaT細(xì)胞中進(jìn)行初步篩選并發(fā)現(xiàn)調(diào)控TGF-β多個(gè)重要蛋白。我們圍繞其中一個(gè)蛋白R(shí)BP75進(jìn)行了深入研究，實(shí)驗(yàn)證實(shí)RBP75可以促進(jìn)TGF-β信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial M