組織因子在骨髓移植GVHD中的作用及信號轉導機制.pdf

1、第一部分 TNFα協(xié)同CD8+T細胞誘導受體HUVEC細胞凋亡的實驗研究
　　 目的：異基因造血干細胞移植時，循環(huán)血中損傷脫落的內皮細胞的數量明顯增加，且與移植相關的血管并發(fā)癥成正相關。移植的動物模型中，內皮細胞凋亡是發(fā)生于其它組織器官損傷之前的早期事件，而其發(fā)生的機制及誘導因素尚不明確，我們的研究目的是以細胞因子TNFα為誘導因素，觀察異基因CD8+T細胞導致血管內皮細胞凋亡的體外效應。
　　 方法：采用密度梯度法分離

2、人周圍血單個核細胞，用CD8+T細胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD8+T細胞。將HUVEC細胞株分為4組，分別是1)1640對照組2)低劑量TNFα處理組3)無TNFα處理混合淋巴細胞培養(yǎng)組4)低劑量TNFα處理混合淋巴細胞培養(yǎng)組。用AnnexinV和PI雙標后，熒光免疫顯微鏡及流式細胞儀進行凋亡分析.
　　 結果：低劑量5ng/mlTNFα不能引起HUVEC凋亡，與1640對照組比較無顯著性差異p＞0.05。用同樣劑量的TNF

3、α預處理HUVEC后，與CD8+T細胞進行混合培養(yǎng)，流式細胞儀檢測顯示其24小時時間點的早期凋亡率高達83.6±0.42[％]，是非TNFα預混合培養(yǎng)組的5.8倍。組間比較存在非常顯著的統(tǒng)計學差異p＜0.001。
　　 結論：體外供體CD8+T淋巴細胞能夠引起受體血管內皮細胞凋亡。低劑量的TNFα的協(xié)同對凋亡起明顯的放大作用。
　　 第二部分 A20和Caspase3在異基因CD8+T細胞致HUVEC凋亡途徑中的表達及意

4、義
　　 目的：異基因造血干細胞移植時，血管內皮細胞凋亡不僅是移植相關血栓并發(fā)癥的重要病理特征，而且可能在移植物抗宿主病的組織器官損傷中起早期介導作用。通過檢測血管內皮細胞凋亡信號途徑中A20蛋白及Caspase3的表達以明確凋亡發(fā)生的機制.
　　 方法：采用密度梯度法分離人周圍血單個核細胞，用CD8+T細胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD8+T細胞。HUVEC細胞株經過低劑量TNFα處理后與CD8+T細胞進行混合培養(yǎng)。用

5、Annexin-V和PI雙標后，流式細胞儀對HUVEC進行凋亡分析，用全波長熒光分光光度計測定凋亡相關蛋白Caspase3的活性。用westen-blot方法檢測HUVEC中A20蛋白的表達。
　　 結果：異基因CD8+T在與HUVEC混合后可引起HUVEC凋亡，流式細胞儀檢測顯示其24小時時間點的早期凋亡率最高，達83.6±0.42[％]。而晚期凋亡相關蛋白Caspase3活性在48小時時間點達高峰，熒光強度為13.59±0.

6、27，此后顯著性降低，與對照組比較存在非常顯著的統(tǒng)計學差異p＜0.001。A20蛋白在異基因CD8+T細胞導致的HUVEC凋亡中,與其嚴重程度成負相關。
　　 結論：體外供體CD8+T淋巴細胞導致受體血管內皮細胞凋亡途徑中Caspase3的激活介導了HUVEC凋亡的發(fā)生。信號蛋白A20可能對凋亡的發(fā)生起負調節(jié)作用。
　　 第三部分組織因子胞內段小干擾RNA載體的構建及其對HUVEC凋亡的保護作用
　　 目的：構建

7、組織因子胞內段小干擾RNA載體，將其轉入HUVEC細胞株后，觀察混合淋巴細胞反應中，在基本不影響凝血功能的情況下，對HUVEC凋亡的保護作用。
　　 方法：體外設計特異性干擾組織因子胞內段氨基酸序列合成的小干擾片斷，將其插入質粒DNA后轉入大腸桿菌中大量擴增，抽提質粒后，用脂質體將其轉入HUVEC細胞株中，磁珠法檢測混合淋巴細胞反應中，培養(yǎng)上清液的APTT時間,流式細胞儀分析轉染空載對照組、siRNAI、siRNAII凋亡細胞百

8、分率。
　　 結果：與空載對照組比較，轉染了siRNAI質粒的HUVEC的凋亡率顯著下降。轉染了siRNAII質粒的HUVEC的凋亡率雖然不如siRNAI下降明顯，但與空載對照組比較，也有顯著性差異，P＜0.05。測定的培養(yǎng)上清中APTT時間，與空白對照組比較差異無顯著性，P＞0.05。
　　 結論：成功構建的組織因子胞內段小干擾RNA質粒，在不影響凝血功能的情況下，可對內皮細胞的凋亡起保護作用。
　　 第四部分

9、 CD4+T誘導受體HUVEC組織因子表達的信號轉導機制
　　 目的：阻斷組織因子細胞內段的蛋白的合成，在基本不影響凝血的情況下，可以對異基因T細胞所導致的內皮細胞的凋亡起保護作用。而內皮細胞的凋亡介導了早期GVHD的發(fā)生，那么下調TF胞內段的表達可能可以減輕GVHD的程度而不影響正常凝血。如果移植后發(fā)生GVHD的同時伴發(fā)血栓并發(fā)癥時，下調細胞內外段的TF的表達可以起抗凝血和減輕GVHD的雙重作用。而組織因子表達的細胞內信號調控

10、機制尚不清楚，本實驗通過檢測異基因CD4+T誘導HUVEC組織因子表達時細胞內信號分子的表達，為臨床尋找新的治療靶點提供實驗室依據。
　　 方法：采用密度梯度法分離人周圍血單個核細胞，用CD4+T細胞亞群陰性分選柱試劑盒分選出CD4+T細胞。HUVEC細胞株經過γ干擾素預處理后與CD4+T細胞進行混合培養(yǎng)。用流式細胞儀檢測HUVEC組織因子的表達，real-time-PCR檢測組織因子mRNA的轉錄狀況。Westen-blot檢

11、測信號分子JNK、P38-MAPK的表達及I-κα的磷酸化狀態(tài)。
　　 結果：異基因CD4+T細胞誘導HUVEC組織因子表達時，TF在混合反應后12小時明顯增加，24小時達到高峰，持續(xù)至48小時后逐步降低到基礎水平。而組織因子的轉錄活性在6小時時間點達到高峰，持續(xù)至48小時后逐步降低。細胞內信號分子JNK、P38-MAPK的蛋白和I-κα的磷酸化的蛋白在1小時內均有表達，與對照組比較，均存在顯著性差異P＜0.05。